Sử dụng diatomite cố định vi khuẩn bacillus subtilis HU58 cho bê tông tự liền vết nứt

Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(32)-2017 
 75 
SỬ DỤNG DIATOMITE CỐ ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 
HU58 CHO BÊ TÔNG TỰ LIỀN VẾT NỨT 
Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh(1), Phạm Văn Hùng(1), 
Nghị Mai Phương(1), Nguyễn Khánh Sơn(1) 
(1) Trường Đại học Bách Khoa (VNU-HCM) 
Ngày nhận 29/12/2016; Chấp nhận đăng 29/01/2017; Email: nnthuynh@hcmut.edu.vn 
Tóm tắt 
Vi khuẩn được sử dụng như một thành phần của phối liệu bê tông nhằm tạo ra các sản 
phẩm khoáng đặc trưng. Các sản phẩm khoáng này đóng vai trò cải thiện tính chất cơ lý của 
vật liệu bê tông ở cả giai đoạn sớm lẫn dài ngày. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn Bacillus 
subtilis HU58 được sử dụng cùng với diatomite Lâm Đồng, nhằm tạo ra vật liệu bê tông vi 
khuẩn có khả năng tự liền trong thời gian dài. Khả năng tự liền được khảo sát trong thời gian 
24 tháng. Các phương pháp phân tích thành phần khoáng và vi cấu trúc vật liệu cho thấy mức 
độ hình thành các sản phẩm khoáng từ vi khuẩn ở dạng các tinh thể calcite tăng theo thời gian. 
Với các mẫu vữa (40x40x160mm), cả cường độ chịu nén (61MPa so với 57MPa) và cường độ 
chịu uốn (11MPa so với 9MPa) đạt cao hơn so với mẫu đối chứng không có vi khuẩn. Với quy 
mô mẫu lớn hơn, các mẫu bê tông (150x150x150mm) có cường độ chịu nén khoảng 18% so với 
mẫu bê tông thường không vi khuẩn (ở mốc 60 ngày). Nhằm kiểm soát quá trình tạo khoáng 
của vi khuẩn tốt hơn, vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 cùng các chất dinh dưỡng được cố định 
trong diatomite dưới dạng các viên nén trước khi trộn vào bê tông. Để khảo sát, vết nứt (1-
1,8mm) được tạo ra trên các mẫu trụ sau khi xi măng kết thúc đóng rắn. Các kết quả về thử 
nghiệm độ thấm nước qua vết nứt này chứng minh cho khả năng làm liền vết nứt của vi khuẩn. 
Từ khóa: bê tông tự liền, calcite, Bacillus subtilis, bê tông vi khuẩn 
Abstract 
MATERIALS ANALYSIS AND PHYSIO-MECHANICAL PERFORMANCE OF 
TAILOR-MADE MORTAR/CONCRETE WITH BACTERIA 
According to recent studies, physio-mechanical properties of concrete materials could be 
improved at both early and later age by the incorporation of precipitated product from 
bacteria. In this experiment, we studied the use of Bacillus subtilis HU58 protected in diatomite 
micro-pores structure to formulate bacterial concrete. The results obtained from mineral 
composition and microstructure analysis revealed that an increasing crystallinity of calcite 
precipitated by bacteria over incubation time. Such generating product prove its useful in the 
enhancement of both compressive and flexural strengths of bacteria modified mortar in 
comparision with controlled Porland cement mortar: 61MPa > 57MPa (in compression) and 
11MPa > 9MPa (in flexion). Similar results was obtained on sample series of bacterial 
concrete with higher compressive strength (around 18 %) after 60 days. Furthermore, we could 
take into account a self-healing ability on artificial crack (from 1 to 1.8mm in width) with 
formulated mortars that contain diatomite immobilized bacteria. 
Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh Sử dụng Diatomite cố định vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 
 76 
1. Tổng quan 
Trong xu hướng phát triển bền vững, các vật liệu “thông minh” với khả năng tự liền, tự 
hàn gắn là một trong số những giải pháp mang nhiều triển vọng. Từ đó, việc chế tạo bê tông vi 
khuẩn hay bê tông sinh học là một bước phát triển tích cực trong lĩnh vực vật liệu xây dựng. Cơ 
chế sinh học trong vật liệu bê tông tự liền vết nứt mô phỏng theo hiện tượng liền xương tự 
nhiên của cơ thể người. Các vết nứt tế vi hoặc các vết nứt hở được tạo thành trong pha nền xi 
măng thủy hóa có thể tự liền lại bằng chất kết dính tự nhiên từ bên trong. So với các kỹ thuật tự 
liền khác cho bê tông như tự liền hóa học hoặc tự liền tự nhiên, cơ chế tự liền sinh học có nhiều 
ưu thế hơn và đồng thời thân thiện hơn với môi trường [1]. Trong vật liệu bê tông. Quá trình tạo 
khoáng sinh học cho phép lấp đầy, làm liền và ngăn các vết nứt cũng như các khuyết tật và lỗ 
xốp mao quản phát triển sau quá trình đóng rắn của xi măng. Các nghiên cứu hiện tại về mảng 
đề tài này cho thấy có nhiều chủng vi khuẩn khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể 
tạo ra vật liệu bê tông có khả năng tự liền vết nứt theo cơ chế này. 
Các chủng vi khuẩn có khả năng chịu môi trường kiềm cao, chịu được nhiệt thủy hóa và 
các điều kiện khắc nghiệt trong bê tông đã được nghiên cứu và ứng dụng. Bacillus pasteurii và 
Bacillus pseudofirmus cohnii DSM 8715 đã được nghiên cứu và cho khả năng chế tạo bê tông tự 
liền [2]. Dung dịch vi khuẩn và chất dinh dưỡng cần thiết bao gồm calcium lactate hoặc urea và 
CaCl2 với mật độ vi khuẩn đủ cao cho khả năng tạo khoáng [2]. Theo nghiên cứu của Al-Thawadi 
và Ghosh cùng cộng sự, hầu hết các kết quả khả thi đều cho thấy khoáng calcite tạo thành từ bên 
trong bê tông do tác nhân vi khuẩn tiếp tục phát triển theo thời gian với tạo ra hiệu ứng tự liền [3]. 
Trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào hai nội dung chính. Thứ nhất, chúng 
tôi cố gắng làm sáng tỏ cơ chế tự liền kết hợp giữa sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 và 
diatomite với cấu trúc xốp tự nhiên làm môi trường bảo vệ, cố định vi khuẩn. Từ mục đích này, vi 
khuẩn và các chất dinh dưỡng sẽ được trộn với diatomite dạng bột và tạo hình dạng viên hình trụ 
bọc hồ xi măng. Sau đó, các viên diatomite đã cố định vi khuẩn này được sử dụng để nghiên cứu 
khả năng tự liền của vật liệu bê tông, cũng như độ bền cơ của vữa xi măng. Cuối cùng, khả năng, 
hiệu quả cố định vi khuẩn trong cấu trúc xốp của diatomite, cộng với thí nghiệm chống thấm 
nước qua vết nứt sẽ được thảo luận và phân tích với các mẫu vật liệu. 
2. Phương trình, bảng và hình vẽ 
Dung dịch vi khuẩn được chuẩn bị từ urea, CaCl2, và vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 (mật 
độ 109cfu/g) với tỷ lệ phối trộn cho trong bảng 1. Chúng tôi sử dụng nguồn nguyên liệu diatomite 
Lâm Đồng tự nhiên. Diatomite nguyên liệu có hàm lượng silica dạng gel khoảng 70% khối lượng, 
các khoáng alumino-silicate chiếm 20%. Hỗn hợp phối liệu đồng nhất của vi khuẩn, chất dinh 
dưỡng và bột diatomite sấy khô được trộn đều trong 10 phút bằng máy trộn vữa kiểu hành tinh. 
Với một lượng khoáng sét tương đối cao trong thành phần, hỗn hợp diatomite đáp ứng được 
phương pháp tạo hình ép dẻo để tạo ra các viên hình trụ cao 10mm, đường kính 10mm (hình 1). 
Tỷ lệ giữa dung dịch vi khuẩn và bột diatomite được giữ cố định ở 1,26% khối lượng xi măng 
trong mẫu. Các viên diatomite sau đó được phủ hồ xi măng (w/c=0,5) và phơi khô tự nhiên trong 
không khí trước khi sử dụng như một thành phần cốt liệu cho bê tông. 
Bảng 1. Tỷ lệ phối trộn dung dịch vi khuẩn (1,26% khối lượng xi măng) trong các mẫu vữa 
 Bacillus subtilis HU58 Urea CaCl2.H2O Nutrient 
Broth 
Tổng 
Phần trăm khối lượng 0,49 0,44 0,22 0,11 1,26 
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(32)-2017 
 77 
Hình 1. Viên diatomite cố định vi 
khuẩn (a) và viên diatomite sau khi bọc 
hồ xi măng (b) 
Các vật liệu khác dùng cho phối liệu bê tông bao gồm xi măng Portland Hà Tiên PC40, cát 
tiêu chuẩn, cốt liệu đá (Dmax = 20mm) và nước máy. Nguyên liệu dùng cho chế tạo bê tông thỏa mãn 
các tiêu chuẩn chất lượng Việt Nam TCVN. Một lượng nhỏ dung dịch vi khuẩn (1,26% khối lượng 
xi măng) được thêm vào hỗn hợp vữa tươi giống như một phụ gia hóa học nhằm tạo ra vữa vi 
khuẩn. Các mẫu vữa dạng thanh 40x40x160mm (vữa vi khuẩn và vữa đối chứng không vi khuẩn) 
được tạo hình và dưỡng hộ trong điều kiện phòng thí nghiệm (theo TCVN 6016:1995) đến các mốc 
đo cường độ cơ học. Các mẫu bê tông đối chứng mác M300 cũng được chế tạo theo tiêu chuẩn Việt 
Nam. Mẫu bê tông vi khuẩn được chế tạo theo hai nhóm. Một nhóm sử dụng các viên diatomite cố 
định vi khuẩn (0,5% khối lượng xi măng), trộn như một dạng cốt liệu cho bê tông. Nhóm còn lại sử 
dụng dung dịch vi khuẩn (0,5% khối lượng xi măng) trộn trực tiếp với nước máy. Tất cả các mẫu bê 
tông được tạo hình trong khuôn lập phương, mẫu kích thước 150x150x150mm. Sau khi tháo khuôn, 
các mẫu được dưỡng hộ trong điều kiện phòng thí nghiệm trong 60 ngày để đo cường độ chịu nén. 
Với thí nghiệm về khả năng tự liền, chúng tôi sử dụng các mẫu hình trụ (đường kính 90mm). Mẫu 
trụ này được cắt thành từng lát dày 20cm tại mốc 14 ngày tuổi. Sau đó, các mẫu được bẻ gãy thành 
2 phần (dùng phương pháp ép chẻ). Các mẫu đã bẻ gãy được giữ lại đúng vị trí và dưỡng hộ trong 
bể nước máy. Các mẫu này sau đó 28 ngày được vớt lên để tiến hành các phân tích vi cấu trúc và 
đánh giá mức độ tự liền. 
3. Kết quả 
3.1. Khả năng tạo calcite trong cấu trúc xốp của diatomite 
Như đã đề cập, chúng tôi đặt mục tiêu kiểm soát quá trình tạo khoáng bằng các viên diatomite 
với cấu trúc xốp tự nhiên. Hình 2 mô tả thí nghiệm viên diatomite cố định vi khuẩn ngâm trong nước 
máy: viên còn nguyên vẹn bọc hồ xi măng (a) và viên bị bẻ ra làm hai phần (b). Trong hình 1c và 1d, 
có thể nhận thấy trên bề mặt gãy của viên diatomite (sau 3 ngày), có sự xuất hiện nhiều sản phẩm rắn 
màu trắng. Từ hình ảnh bên trong viên diatomite cố định vi khuẩn, ta nhận thấy có sự khác biệt rõ 
ràng. Bên trong viên không bị phá hủy ban đầu, khi ngâm trong nước, vi khuẩn được bảo vệ bởi 
diatomite và lớp vỏ hồ xi măng nên hầu như không có cơ hội tiếp xúc nước và không khí bên ngoài. 
Tuy nhiên, sau khi viên bị phá hủy và ngâm lại vào nước, vi khuẩn tiếp xúc đầy đủ với nước và không 
khí, quá trình hoạt động tạo calcite của vi khuẩn diễn ra. Có thể thấy rõ các vị trí màu trắng bên trong 
mẫu. Phần bột này nhiều khả năng là các tinh thể calcite với màu trắng đặc trưng. 
Chúng tôi tách lấy và cho các sản phẩm màu trắng này qua sàng 90μm để phân tích thành 
phần khoáng. Kết quả phân tích XRD (hình 3) cho thấy có sự tăng liên tục cường độ peak nhiễu xạ 
đặc trưng của calcite trong các mẫu theo thời gian. Phương pháp phân tích nhiệt lượng vi sai DSC 
cũng được sử dụng để đánh giá sự tạo thành calcite thông qua peak thu nhiệt đặc trưng của quá trình 
phân hủy calcite ở 840oC. Các kết quả phân tích này cho thấy, rõ ràng theo thời gian trong môi 
trường đầy đủ độ ẩm, không khí, quá trình tạo khoáng của vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 diễn ra 
trong cấu trúc xốp của diatomite. Trong ảnh vi cấu trúc SEM (hình 2), có thể thấy được vi khuẩn tại 
Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh Sử dụng Diatomite cố định vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 
 78 
các vị trí lỗ xốp của diatomite. Khi so sánh với các nghiên cứu về hình thái vi khuẩn của Zweers 
cùng cộng sự, [4] và ảnh TEM của Bacillus subtilis trong nghiên cứu của Yoon [5], có sự tương 
đồng rõ rệt giữa cấu trúc dạng que đặc trưng của vi khuẩn. Hơn nữa, sau thời gian 5 tháng, chỉ có 
một lượng nhỏ vi khuẩn sụt giảm (2,7x108cfu/g) so với mật độ HU58 ban đầu là 109cfu/g. Có đến 
80% lượng vi khuẩn vẫn còn sống và có khả năng tạo khoáng trong viên diatomite. 
Hình 2. Trái: (a) viên 
diatomite trong nước; 
(b) viên diatomite bẻ 
đôi ngâm trong nước; 
(c) bề mặt bên trong 
viên diatomite đã bẻ 
đôi; (d) calcite tạo 
thành bên trong viên 
diatomite. Right: ảnh 
SEM diatomite cố định 
vi khuẩn 
Hình 3. (a) phổ XRD của các sản phẩm màu trắng trong viên diatomite; (b) kết quả phân tích nhiệt 
DSC của các sản phẩm trắng 
3.2. Độ bền cơ của các mẫu vi khuẩn 
Hình 4. Cường độ chịu uốn (a) và cường độ chịu nén (b) của các mẫu vữa vi khuẩn 
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(32)-2017 
 79 
Kết quả đo trong hình 4 cho thấy, cả 
cường độ chịu uốn và chịu nén của các mẫu 
vữa vi khuẩn đều cao hơn so với mẫu đối 
chứng không vi khuẩn. Sau mốc thời gian 2 
năm dưỡng hộ, cường độ chịu nén và chịu 
uốn của mẫu vữa vi khuẩn lần lượt đạt 
61MPa và 11MPa so với 57MPa và 9MPa 
của mẫu đối chứng. Trong quy mô mẫu nhỏ, 
dung dịch vi khuẩn được phân tán trực tiếp 
vào hỗn hợp phối liệu mà không sử dụng viên 
nén diatomite. Quá trình tạo khoáng calcite 
trong pha nền xi măng thủy hóa diễn ra mãnh 
liệt ngay từ đầu. Cường độ chịu nén khi sử 
dụng Bacillus subtilis HU58 (cao hơn 36% so 
với mẫu đối chứng) cho kết quả tốt hơn khi so 
sánh với kết quả sử dụng Shewanella trong 
nghiên cứu của Ghosh cùng cộng sự [6] (cao 
hơn 25% so với mẫu đối chứng). 
Với các kết quả đo cường độ chịu nén trong hình 5, cả hai nhóm mẫu vi khuẩn (vi khuẩn tự 
do và vi khuẩn cố định trong diatomite) đều cho kết quả cao hơn mẫu đối chứng. Các mẫu bê tông 
khi sử dụng vi khuẩn cố định trong diatomite cho giá trị cường độ thấp hơn so với mẫu bê tông vi 
khuẩn trộn trực tiếp không cố định. Có thể nhận thấy, vi khuẩn được bảo vệ trong cấu trúc xốp của 
diatomite và lớp vỏ hồ xi măng bọc quanh viên, khả năng tiếp xúc với môi trường ngoài thuận lợi 
cho quá trình tạo khoáng không cao bằng vi khuẩn tự do. Tuy nhiên, với mức tăng 17% so với mẫu 
đối chứng, mẫu bê tông vi khuẩn cố định trong diatomite vẫn cho kết quả cao hơn so với nghiên cứu 
của Wang [7] sử dụng diatomite dạng bùn và trộn chung với nước (cao hơn 15% so với mẫu đối 
chứng). Các kết quả cho thấy được hiệu quả bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường khắc nghiệt của bê 
tông trong thời gian dài, từ đó phát huy được khả năng tạo khoáng sinh học, giúp gia tăng cường độ 
và tạo hiệu ứng tự liền vết nứt. 
3.3. Khả năng tự liền vết nứt 
Hình 6. Ảnh chụp vết nứt 1,8mm 
được lấp đầy theo thời gian (a) 
và ảnh âm bản (b) 
Hình 5. Cường độ chịu nén của mẫu bê tông 
vi khuẩn và mẫu đối chứng 
Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh Sử dụng Diatomite cố định vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 
 80 
Thí nghiệm đánh giá mức độ tự liền qua các mẫu trụ (đường kính 90mm, chiều dày 20mm) 
với vết nứt được tạo ra có chiều rộng 1,8mm. Hình 6a cho thấy vết nứt cắt ngang qua làm vỡ 
viên diatomite cố định vi khuẩn ra. Trong khoảng thời gian dưỡng hộ ẩm từ 3 đến 28 ngày, hai 
phần của lát mẫu hình trụ liền lại với nhau. Phân tích vi cấu trúc bằng phương pháp SEM kết 
hợp thành phần hóa EDX cho kết quả ở hình 7. Sản phẩm khoáng calcite được hình thành dưới 
dạng các tinh thể hình que rõ ràng (hình 7). Cả phân tích định tính và phân tích định lượng 
được sử dụng để chứng minh cho sự hình thành calcite làm liền vết nứt theo thời gian. Có thể 
nhận thấy vi khuẩn được kích hoạt khả năng tạo khoáng khi viên nén diatomite bị phá vỡ. Vi 
khuẩn cùng các chất dinh dưỡng gặp môi trường ngoài thuận lợi tạo khoáng lấp đầy là dần làm 
kín vết nứt. So sánh với kết quả trong nghiên cứu của Wang [8], sử dụng Bacillus sphaericus 
LMG 22557, vết nứt với chiều rộng tối đa 0,97mm; nghiên cứu của chúng tôi sử dụng diatomite 
dạng viên nén cố định Bacillus subtilis HU58 cho phép làm liền vết nứt 1,8mm. 
Hình 7. Ảnh SEM và phổ EDX sản phẩm lấp đầy vết nứt 
(a) (b) 
Hình 8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng tự liền (a) và biểu đồ tốc độ liền vết nứt theo 
thời gian của mẫu vi khuẩn tự do và vi khuẩn cố định (b) 
Hình 8 mô tả thí nghiệm về khả năng chống thấm nước qua vết nứt tự liền theo thời gian. 
Các kết quả đo cho phép đánh giá khả năng tự liền qua công thức tốc độ chống thấm nước = 
(V0 – Vt)100%/Vt, trong đó, V0 là tốc độ thấm nước ban đầu, Vt là tốc độ thấm nước của mẫu tự 
liền tại thời điểm t. Có sự khác biệt về độ dốc trên đường cong tốc độ tự liền giữa hai nhóm 
mẫu khi chọn mốc tạo vết nứt là 14 và 28 ngày tuổi. Do sự giảm mật độ vi khuẩn, khả năng tự 
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(32)-2017 
 81 
liền của mẫu vi khuẩn tự do (không được bảo vệ trong diatomite) giảm theo thời gian. Thời 
điểm tạo vết nứt càng lâu, mật độ vi khuẩn còn sống càng thấp, khả năng tự liền càng thấp. 
Ngược lại, mật độ vi khuẩn được duy trì ở mức cao, không có sự khác biệt về độ dốc trong đồ 
thị về khả năng tự liền của mẫu diatomite cố định vi khuẩn. 
4. Kết luận 
Trong phạm vi của nghiên cứu này, diatomite Lâm Đồng giúp cố định và bảo vệ vi khuẩn 
Bacillus subtilis HU58. Sản phẩm khoáng calcite tạo thành nhờ hoạt tính sinh học vi khuẩn khi 
viên diatomite vỡ ra, vi khuẩn trong các lỗ xốp của diatomite được tiếp xúc với môi trường 
ngoài. Khi trộn các viên diatomite cố định vi khuẩn vào vữa, sau thời gian 2 năm, cường độ 
chịu nén và chịu uốn của mẫu cao hơn so với mẫu đối chứng không vi khuẩn lần lượt là 7% và 
22%. Cường độ chịu nén của mẫu bê tông có viên nén diatomite cố định vi khuẩn cũng cao hơn 
mẫu đối chứng (14% ở 60 ngày). Các kết quả phân tích góp phần chứng minh và làm rõ cho cơ 
chế tự liền vết nứt nhờ vào hoạt tính sinh học vi khuẩn. Kết quả đo độ thấm nước qua vết nứt 
cho thấy hiệu quả của việc cố định vi khuẩn trong diatomite khi chế tạo bê tông tự liền. Hiệu 
quả tự liền sau 28 ngày đạt được rất cao. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ đi vào định lượng và khảo 
sát động học kết tinh calcite nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 trong bê tông với môi trường 
nước máy và nước biển. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] A. Talaiekhozan, A. Keyvanfar, A. Shafaghat, R. Andalib, M.A. Majid, M.A. Fulazzaky, et al., 
A Review of Self-healing. Concrete Research Development, J. Environ. Treat. Tech. 2 (2014) 
1–11. 
[2] S.K. Ramachandran, V. Ramakrishnan, S.S. Bang, Remediation of concrete using 
microorganisms, ACI Mater. J. 98 (2001). 
10154 (accessed February 26, 2015). 
[3] S.M. Al-Thawadi, Ureolytic bacteria and calcium carbonate formation as a mechanism of 
strength enhancement of sand, J Adv Sci Eng Res. 1 (2011) 98–114. 
[4] J.C. Zweers, I. Barák, D. Becher, A.J. Driessen, M. Hecker, V.P. Kontinen, et al., Towards the 
development of Bacillus subtilis as a cell factory for membrane proteins and protein complexes, 
Microb. Cell Factories. 7 (2008) 10. 
[5] K.-Y. Yoon, J.H. Byeon, J.-H. Park, J. Hwang, Susceptibility constants of Escherichia coli and 
Bacillus subtilis to silver and copper nanoparticles, Sci. Total Environ. 373 (2007) 572–575. 
[6] V. Wiktor, H.M. Jonkers, Quantification of crack-healing in novel bacteria-based self-healing 
concrete, Cem. Concr. Compos. 33 (2011) 763–770. 
[7] R. Pei, J. Liu, S. Wang, M. Yang, Use of bacterial cell walls to improve the mechanical 
performance of concrete, Cem. Concr. Compos. 39 (2013) 122–130. 
[8] J.Y. Wang, H. Soens, W. Verstraete, N. De Belie, Self-healing concrete by use of 
microencapsulated bacterial spores, Cem. Concr. Res. 56 (2014) 139–152.