Bài giảng Công nghệ sinh học thực phẩm - Chương 6: Một số kỹ thuật kiểm tra hiên đại - Phạm Hồng Hiếu

MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA 
HIÊN ĐẠI
ELISA
Enzyme Linked 
Immunosorbent Assay
Kỹ thuật ELISA?
 Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử 
đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & 
carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố...)
 Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử 
dụng kháng thể (antibodies).
 Dùng để định tính và định lượng mẫu.
 Rất nhạy.
 Được ứng dụng nhiều trong y học và thực 
phẩm
 Có khả năng
phát hiện và liên
kết với kháng
nguyên (antigens)
Antibodies
 Là những
Proteins được tiết
ra bởi tế bào B-
lymphocytes (bạch
cầu) ở động vật có
xương sống.
IgG molecule
Fab 
fragments
Fc 
fragments
Các bước cơ bản của 
phương pháp ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
1. Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’).
2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng 
(‘immuno’).
3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2 
có gắn với enzyme (‘enzyme-linked’).
4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường 
tạo hợp chất màu) 
Màu của sản phẩm= đo được sự hiện 
diện của antigen
Substrate
Primary 
antibody
Secondary 
antibody
Different antigens in sample
Coloured 
product
Botrytis 
cinerea
conidiophore
Chuẩn bị mẫu
Place half a 
raspberry in 
tube
Add 2ml 
PBS Break up tissue with 
glass rod
Filter into 
new tube 
using 
muslin
Coating the wells
 Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)
 Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu 
hấp thu vào bề mặt plastic.
Thêm kháng thể 
(primary antibody)
 Thêm vào khoảng 
4 giọt primary 
antibody (mouse 
monoclonal) vào mỗi 
giếng
Sản xuất kháng thể đơn dòng 
(Monoclonal antibody)
Fuse 
B-lymphocytes with 
myeloma cells
Inject 
mouse with 
antigen
Grow mouse 
myeloma (tumour) 
cells in culture
Obtain 
Mouse spleen 
B-lymphocytes
Antibody-producing 
hybridoma cells
Unlimited supply 
of antibody specific 
for single epitope
Keep clone 
producing antibody 
which best detects 
antigen
Screen 
hybridomas 
for antibody 
production
Select fused 
and reproducing 
hybridoma cells 
via growth medium
B-lymphocyte and 
myeloma mixture
Make 
clones from 
individual 
antibody-
producing 
cells
Sản xuât kháng thể thứ hai
(Secondary antibody)
Mouse serum 
injected into a 
different species, 
e.g. rabbit, goat.
Animal makes 
various antibodies 
against the 
different antigens 
in serum
Take blood 
from animal
Select anti-mouse 
antibodies from 
plasma
Polyclonal 
antibodies which 
can recognise any 
mouse antibody
Thêm vào kháng thể thứ 2 
secondary antibody
 Được liên kết với 
enzyme horseradish 
peroxidase.
 Thêm vào 4 giọt 
secondary antibody (anti-
mouse polyclonal) vào 
mỗi giếng
 Để yên trong khoảng 20 phút.
1. Add antigen
7. Add substrate 
for enzyme
2. Wash with 
PBST
4. Wash with 
PBST
3. Add primary 
antibody
6. Wash with 
PBST
5. Add secondary 
antibody
8. Observe 
colour 
development
Ứng dụng ELISA
 Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực 
vật.
 Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong 
thực phẩm.
 Phát hiện các hormones, kháng sinh trong 
thực phẩm.
 Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
PCR và real-time
PCR là một kỹ thuật
hoàn toàn mở do
vậy chúng ta có khả
năng không phải bị
lệ thuộc vào các
hãng sản xuất kit ở
nước ngoài, nhờ vậy
giá thành sẽ rẽ
PCR
KHÁI NIỆM
• PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction
• PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng 
khuếch đại gen". 
• PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm 
khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không 
cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.
• PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học 
phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di 
truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách 
dòng gene, và xác định huyết thống
LỊCH SỬ
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary
Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về
Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu
này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý
kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà
DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân
tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA
polymerase
THỰC NGHIỆM PCR
• PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác 
định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần 
của gen.
• PCR cần rất nhiều thành phần. 
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại 
- Cặp mồi (primer), 
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. 
- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase 
để xây dựng DNA mới. 
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-
polymerase
THỰC NGHIỆM PCR
PCR machine
Chu kỳ nhiệt: Đây là máy đun
nóng và làm nguội trong ống
phản ứng ở nhiệt độ chính xác
cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa
sự bay hơi của hỗn hợp phản
ứng, phần nắp đậy của máy PCR
cũng được đun nóng, trường hợp
lượng dung dịch phản ứng quá ít,
người ta cho một lớp dầu (natural
oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản
ứng.
Nguyên tắc PCR
1
2
3
4
n
2n
DNA đích
1 Biến tính (94oC 
)
2 Bắt cặp (55-65o C)
3 Kéo dài (72o C)
5’ 3’ 3’ 5’
1. Đoạn mồi
Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo 
– không quá 50 (thường 18-25) nucleotides 
(vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó 
được xác định bằng số lượng cặp base 
(bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo 
bằng base hay nucleotides) 
Mồi
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl2
PCR 
MIX
DNA đích (Template)
2. Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 45 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 
bước:
- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi 
là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA.
- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi 
có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.
- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu 
bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo 
dài
30X-40X
94oC/15s-1min
55-65oC/15s-1min
72oC/30s-3min
Phát hiện 
 qua kích thước (điện di) 
 hay qua trình tự (lai) 
Ct curve
Standard 
curve
Melt 
curve
Real-time PCR
chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại
Laser or 
UV
Camera
Thiết bị Real-time PCR
Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl2
Real-time 
PCR MIX
Target DNA (Template)
Real-time PCR mix
Chất phát huỳnh quang
Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa 
hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen
Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn 
gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa 
ñoaïn gen
Nuoâi caáy PCR
PCR có đặc hiệu không?
PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy
Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện 
tác nhân vi sinh vật 
Mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử
Tách chiết nucleic acid
Chạy PCR
Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả
Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực
Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
Những ứng dụng của PCR
• Vân tay di truyền
• Kiểm tra huyết thống
• Chuẩn đoán bệnh di truyền
• Tách dòng gen
• Gây đột biến điểm
• Phân tích mẫu DNA cổ
• Xác định gen của các đột biến 
• So sánh mức độ biểu hiện của gen