Thẩm định một số phương pháp tách chiết ADN cho phát hiện biến đổi gen

Nghiên cứu này được thực hiện để thẩm định 4 phương pháp tách chiết ADN, trong đó 3 phương pháp theo

TCVN 7606: 2007 (ISO21571: 2005) bao gồm các phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/chloroform, polyvinylpyrrovylidon (PVP) và CTAB. Phương pháp thứ tư là tách ADN bằng bộ kit Wizard clean-up (Promega). Tổng số

11 mẫu thí nghiệm chia thành năm nền mẫu hạt, bột, nước, thức ăn chăn nuôi và thực phẩm đã được khảo sát. Mỗi

mẫu được tách chiết lặp lại 2 lần đối với 4 phương pháp, kèm theo các đối chứng dương tính (lá ngô), âm tính (H2O).

Kết quả cho thấy phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/chloroform không phù hợp cho các nền mẫu nghiên

cứu, trong khi phương pháp PVP có thể dùng cho nền mẫu hạt. Phương pháp CTAB cho ADN tinh sạch có nồng độ

từ 10,7 ng/µl đến 234,6 ng/µl, tỉ lệ quang phổ A260/280 đạt được từ 1,68 đến 2,27. Phương pháp tách ADN bằng bộ

kit Wizard clean-up (Promega) cho ADN tinh sạch có nồngđộ từ 82,8 ng/µl đến 226,2 ng/µl, tỉ lệ bước quang phổ

A260/280 đạt được từ 1,8 đến 2,07. Hai phương pháp tách ADN bằng CTAB và sử dụng kit Wizard clean-up có thể

sử dụng trong các phòng thí nghiệm để tinh sạch ADN cho phát hiện biến đổi gen.

pdf 5 trang kimcuc 4700
Bạn đang xem tài liệu "Thẩm định một số phương pháp tách chiết ADN cho phát hiện biến đổi gen", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên

Tóm tắt nội dung tài liệu: Thẩm định một số phương pháp tách chiết ADN cho phát hiện biến đổi gen

Thẩm định một số phương pháp tách chiết ADN cho phát hiện biến đổi gen
66
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(82)/2017
Study on technical measures for Ha thu o do [Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson] 
at Son Dong commune, Son Tay, Hanoi
Pham Thanh Huyen, Phan Van Truong
Abstract
The experiments were designed to evaluate the effects of growing time, planting distance and fertilizer doses on 
growth, development, yield and quality of F. multiflora. The results showed that the best growing time was in March 
or in October of the year; the planting distance of 40 ˟ 30 cm and fertilizer dose for 1 ha within 2 year including 4 
tons of microbial organic fertilizer + 200 kg N + 400 kg P2O5 + 200 kg K2O. With all the above conditions, the yield of 
Ha thu o do growng in Son Dong commune, Son Tay district, Hanoi city reached 2600 - 2800 kg/ha and the content 
of 2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside was recorded over 2%. 
Key words: Cultivation, Ha thu o do, Fallopia multiflora, high quality and yield
Ngày nhận bài: 13/8/2017
Ngày phản biện: 16/8/2017
Người phản biện: PGS. TS. Ninh Thị Phíp
Ngày duyệt đăng: 10/9/2017
1 Viện Di truyền Nông nghiệp
THẨM ĐỊNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN 
CHO PHÁT HIỆN BIẾN ĐỔI GEN
Lưu Minh Cúc1
TÓM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện để thẩm định 4 phương pháp tách chiết ADN, trong đó 3 phương pháp theo 
TCVN 7606: 2007 (ISO21571: 2005) bao gồm các phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/chloroform, polyvinyl-
pyrrovylidon (PVP) và CTAB. Phương pháp thứ tư là tách ADN bằng bộ kit Wizard clean-up (Promega). Tổng số 
11 mẫu thí nghiệm chia thành năm nền mẫu hạt, bột, nước, thức ăn chăn nuôi và thực phẩm đã được khảo sát. Mỗi 
mẫu được tách chiết lặp lại 2 lần đối với 4 phương pháp, kèm theo các đối chứng dương tính (lá ngô), âm tính (H2O). 
Kết quả cho thấy phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/chloroform không phù hợp cho các nền mẫu nghiên 
cứu, trong khi phương pháp PVP có thể dùng cho nền mẫu hạt. Phương pháp CTAB cho ADN tinh sạch có nồng độ 
từ 10,7 ng/µl đến 234,6 ng/µl, tỉ lệ quang phổ A260/280 đạt được từ 1,68 đến 2,27. Phương pháp tách ADN bằng bộ 
kit Wizard clean-up (Promega) cho ADN tinh sạch có nồngđộ từ 82,8 ng/µl đến 226,2 ng/µl, tỉ lệ bước quang phổ 
A260/280 đạt được từ 1,8 đến 2,07. Hai phương pháp tách ADN bằng CTAB và sử dụng kit Wizard clean-up có thể 
sử dụng trong các phòng thí nghiệm để tinh sạch ADN cho phát hiện biến đổi gen.
Từ khóa: Tách chiết ADN, loại nền mẫu, nồng độ, chất lượng
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tách chiết ADN là khâu đầu tiên quan trọng nhất 
trong tất cả các thí nghiệm sinh học phân tử. Các 
thao tác di truyền của công nghệ gen đều tiến hành 
với ADN (hay RNA). Nguyên tắc cơ bản của việc 
tách chiết ADN bao gồm việc giải phóng ADN có 
mặt trong chất nền và sau đó là tinh sạch ADN khỏi 
các chất ức chế phản ứng PCR (TCVN 7606:2007 
- ISO 21571:2005). ADN tách chiết được cần đảm 
bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để 
thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong 
công nghệ gen thực vật. Đặc biệt trong công tác thử 
nghiệm và giám định biến đổi gen, việc tách chiết 
được ADN có chất lượng cho phản ứng PCR nghĩa 
là các ADN làm khuôn có độ dài phù hợp, sạch về 
mặt hóa học và nguyên vẹn về mặt cấu trúc (TCVN 
7608:2007 - ISO 24276:2007), có nồng độ cao từ các 
nền mẫu khác nhau là vô cùng khó, do trong các sản 
phẩm chế biến hoặc tinh chế ở mức độ cao, ADN 
đã bị phân hủy hầu hết. Có rất nhiều phương pháp 
tách chiết ADN, tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà 
lựa chọn các phương pháp tách ADN cho phù hợp. 
Nghiên cứu này tiến hành thẩm định các phương 
pháp tách chiết ADN theo Tiêu chuẩn Quốc gia 
TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) và phương pháp 
tách bằng bộ kit của Promega để tìm ra phương pháp 
thích hợp nhất cho các nền mẫu nghiên cứu phục vụ 
cho mục đích kiểm tra, xác định biến đổi gen trong 
mẫu phân tích (ISO/IEC 17025).
67
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(82)/2017
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghiên cứu
-11 mẫu thí nghiệm thuộc năm nền mẫu khác 
nhau, bao gồm nền mẫu hạt (đậu tương, ngô), bột 
(bột ngũ cốc, bột đậu xanh, sữa bột), lỏng (sữa đậu 
nành), 3 loại thức ăn chăn nuôi và thực phẩm (ngô 
đóng hộp, bim bim). Mẫu đối chứng âm tính: nước 
cất; mẫu đối chứng dương tính: lá ngô. Tên các loại 
sản phẩm được nêu trong bảng 1.
- Các vật tư, hóa chất đã được liệt kê trong TCVN 
7606:2007 (ISO 21571:2005).
- Bộ kit Wizard ADN clean-up system của 
Promega.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Để đảm bảo tính chính xác trong việc thẩm định 
phương pháp tách ADN (Thompson et al., 2002), 
các nền mẫu tham gia nghiên cứu đã được xử lý 
trước khi tách chiết ADN như sau: 
- Đối với nền mẫu hạt: Nghiền mẫu thành bột mịn.
- Đối với nền mẫu lỏng: Tiến hành ly tâm, lấy 
phần lắng xuống làm mẫu phân tích.
- Đối với nền mẫu bột: Nếu bột thô thì xay mịn 
thành hỗn hợp đồng nhất.
- Đối với mẫu thực phẩm bao gói: 
+ Thực phẩm chứa đường: Nghiền thành bột mịn, 
sau đó cho nước vô trùng vào hòa tan mẫu, đem ly 
tâm để thu lấy phần lắng xuống dùng cho phân tích.
+ Thực phẩm chứa muối dạng bánh (bim bim): 
Tiến hành rửa nhẹ dưới vòi nước chảy, sau đó sấy 
khô ở 700 C trong 2 giờ. Lấy mẫu ra nghiền thành 
dạng bột mịn.
- Đối với thức ăn chăn nuôi: Nghiền thành 
dạng bột.
- Thí nghiệm sử dụng các phương pháp tách 
chiết ADN theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) 
như sau:
Phương pháp dựa trên phenol/chlorofom: Gồm 
các bước phân hủy nhiệt trong sự có mặt của natri 
dodecyl sunfat và hàm lượng EDTA cao, loại bỏ các 
tạp chất (như các phân tử ưa mỡ, các chất polisacarit 
và protein) và các nuclease sử dụng phenol và 
chlorofom. Kết tủa ADN cuối cùng bằng ethanol, 
làm cô đặc DNA và loại trừ các muối và chlorofom 
còn dư. 
Phương pháp dựa trên polyvinyl-pyrrovylidon 
(PVP) bao gồm bước phân giải bằng nhiệt với sự có 
mặt của natri dodexyl sunfat và EDTA hàm lượng 
cao, tiếp theo là bước loại bỏ các tạp chất như các 
phân tử polyphenol, polysacarit, các chất trao đổi và 
các protein hòa tan ra khỏi pha lỏng chứa DNA bằng 
việc kết hợp PVP và amoni axetat. Bước kết tủa bằng 
ancol cuối cùng để thu lấy DNA và loại bỏ các muối. 
Phương pháp dựa trên CTAB: Qua bước phân 
giải bằng nhiệt với sự có mặt của CTAB, tiếp theo là 
các bước loại bỏ các tạp chất như polisacarit, protein 
để thu được ADN tổng số tinh sạch. 
- Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kit 
Wizard ADN clean-up system của Promega: theo 
hướng dẫn của nhà sản xuất (Wizard® ADN Clean-
Up System). 
- So sánh nồng độ và chất lượng của các loại ADN 
đã chiết tách bằng đo quang phổ trên máy nanodrop 
và điện di trên gel agarose 0,8%.
Nồng độ ADN: CADN = A260 nm ˟ 50 ˟ độ pha 
loãng. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch 
(không tạp nhiễm protein) khi tỷ số A260/280 nằm 
trong khoảng 1,8 đến 2. 
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 
- Thời gian nghiên cứu: Tháng 1/2017 đến tháng 
6/2017.
- Địa điểm: Phòng Giám định Sinh vật và Sản 
phẩm biến đổi gen, Viện Di truyền Nông nghiệp.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tiến hành so sánh các phương pháp tách chiết 
ADN: ADN tổng số sau khi đã tách chiết bằng 4 
phương pháp, phenol/chlorofom, PVP, CTAB và kit 
Wizard, được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy 
NanoDrop. Kết quả đo được hiển thị trên bảng 1.
Kết quả đo nồng độ ADN đối với phương pháp 
tách chiết sử dụng phenol/chloroform như bảng 
trên cho thấy, chỉ số A260/280 của tất cả các loại chất 
nền đều <1,8, chỉ có mẫu đối chứng dương tính (+) 
đạt trong mức độ cho phép. Như vậy ADN không 
đủ độ tinh sạch để có thể thực hiện thí nghiệm tiếp 
theo. Các nền mẫu khác tuy nồng độ cao nhưng lại 
quá nhiều chất ức chế khác ngoài ADN nên chỉ số 
A260/280 thấp hơn giá trị 1,8. 
Kết quả đo nồng độ ADN đối với phương pháp 
tách chiết sử dụng PVP cho thấy, chỉ số A260/280 của 
hạt ngô và hạt đậu tương là >1,8; các mẫu còn lại 
đều <1,8. Chỉ có ADN chiết được từ hạt đậu tương 
là tinh sạch, A260/280 trong khoảng cho phép từ 1,98 
- 1,99, mẫu ngô có độ tinh sạch kém hơn với A260/280 
từ 2,1 - 2,48. Điều đó chứng tỏ phương pháp PVP 
thích hợp cho tách hạt đậu tương.
68
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(82)/2017
Đối với phương pháp tách chiết ADN bằng 
CTAB, với kết quả đo như bảng trên, chỉ số A260/280 
của tất cả các mẫu đều nằm trong khoảng từ 1,68 
đến 2,27. Như vậy, ADN tổng số tách chiết được từ 
tất cả các mẫu bằng phương pháp CTAB là tinh sạch 
hơn nhiều so với hai phương pháp trước.
Riêng đối với phương pháp sử dụng bộ kit Wizard 
ADN clean-up system, kết quả đo như bảng 1, chỉ số 
A260/280 của tất cả các mẫu đều nằm trong khoảng từ 
1,8 đến 2,07. Như vậy, ADN tổng số tách chiết được 
từ tất cả các mẫu bằng phương pháp sử dụng bộ kit 
Wizard ADN clean-up system là tinh sạch hơn so 
với phương pháp CTAB, không còn lẫn tạp chất và 
protein.
ADN tổng số của các các mẫu sau khi tách chiết 
bằng phương pháp phenol/chlorofom được vào 
điện di trên gel agarose 0,8% trong 30 phút ở 100 
miliAmp và đưa vào soi dưới tia cực tím. Ảnh chụp 
bằng Hệ thống xử lí hình ảnh gen - VisionCapt cho 
kết quả như sau:
Bảng 1. Kết quả đo nồng độ ADN (độ tinh sạch) tách chiết trên máy NanoDrop
STT Tên chất nền
Số lần 
lặp
Phương pháp 
phenol/
chlorofom
Phương pháp 
PVP
Phương pháp 
CTAB
Phương pháp 
kit Wizard
Nồng 
độ 
ADN
(ng/µl)
A260/280
Nồng 
độ 
ADN
(ng/µl)
A260/280
Nồng 
độ 
ADN
(ng/µl)
A260/280
Nồng 
độ 
ADN
(ng/µl)
A260/280
1 Hạt ngô
1 78,5 1,52 5,5 2,48 78,5 2,1 176,3 1,82
2 123,8 1,63 8,5 2,1 54,2 2,07 184,4 2,02
2 Hạt đậu tương
1 176,3 1,07 89,5 1,98 156,5 1,85 163,5 1,88
2 177,1 1,14 88 1,99 163,9 1,92 177,1 1,96
3 TACN C20 con cò
1 405,7 1,46 263,2 1,66 234,6 2,02 226,2 1,87
2 408,3 1,58 205,2 1,46 209,1 2,07 159,1 2,01
4 TACN554 - HiGro
1 281,6 1,24 307,3 1,58 89,5 1,90 169,5 1,98
2 320,5 1,32 321,3 1,53 94,8 1,81 154,2 2,01
5
TACN 
VH - 20S 
- Viethope
1 736,9 1,73 443,4 1,69 113,4 1,68 143,4 1,98
2 648,3 1,69 426,2 1,55 106,2 1,76 126,2 1,86
6 Bim bim Ostar
1 9,9 1,12 20,9 1,23 40,7 2,27 120,7 2,07
2 111,4 1,29 31,8 1,36 40,5 1,80 140,5 1,86
7 Sữa đậu nành Fami
1 158,6 1,25 34,9 1,76 74,9 2,26 134,9 2,06
2 104,5 1,07 32,2 1,63 72,2 2,13 152,2 2,03
8
Bột 
đậu xanh 
Rồng Vàng
1 22,4 1,09 360,9 1,12 161,2 2,06 179,1 2,03
2 18,6 1,1 354,4 1,15 154,4 2,13 156,3 2,03
9 Sữa bột
1 18,5 1,15 2,3 1,69 48,7 1,93 122,7 1,82
2 18,6 1,19 8,8 1,08 48,8 1,97 116,8 1,88
10 Ngô đóng hộp
1 688,5 1,67 3,5 1,67 58,6 1,97 88,6 1,91
2 685,3 1,47 10,1 1,47 52,8 1,8 82,8 1,9
11 Bột ngũ cốc
1 13,5 1,21 22,9 1,36 68,4 1,76 88,4 2,01
2 10,1 1,45 18,7 1,29 75,6 1,79 85,6 1,96
H2O
ĐC (-) 1 1,8 4,01 0 -0,11 0 -0,11 0,1 -0,06
Mẫu lá ngô
ĐC (+) 1 201,2 1,86 259 1,91 151 1,97 158,9 1,91
69
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(82)/2017
Hình 1. Kết quả điện di ADN trên gel agarose 0,8% đối với phương pháp phenol/chlorofom
Giếng M: marker λ ADN chuẩn nồng độ 200 ng; 1: ĐC (-); 2-3: Hạt ngô; 4-5: Hạt đậu tương; 6-7: TACN C20 Con 
cò; 8-9: TACN554 Higro; 10-11: TACN VH20S; 12-13: Bim bim Ostar; 14-15: Sữa đậu nành Fami; 16-17: Bột đậu xanh 
Rồng Vàng; 18-19: Sữa bột; 20-21: Ngô đóng hộp; 22-23: Bột ngũ cốc; 24: ĐC (+)
Hình 2. Kết quả điện di ADN trên gel agarose 0,8% đối với phương pháp PVP
Giếng M: marker λ ADN chuẩn nồng độ 200 ng; 1-2: Hạt ngô; 3-4: Hạt đậu tương; 5-6: TACN C20 Con cò; 7-8: 
TACN554 Higro; 9-10: TACN VH20S; 11-12: Bim bim Ostar; 13-14: Sữa đậu nành Fami; 15-16: Bột đậu xanh Rồng 
Vàng; 17-18: Sữa bột; 19-20: Ngô đóng hộp; 21-22: Bột ngũ cốc; 23: ĐC (-); 24: ĐC (+)
Hình 3. Kết quả điện di ADN trên gel agarose 0,8% đối với phương pháp CTAB
Giếng M: marker λ ADN chuẩn nồng độ 200 ng; 1-2: Hạt ngô; 3-4: Hạt đậu tương; 5-6: TACN C20 Con cò; 7-8: 
TACN554 Higro; 9-10: TACN VH20S; 11-12: Bim bim Ostar; 13-14: Sữa đậu nành Fami; 15-16: Bột đậu xanh 
Rồng Vàng; 17-18: Sữa bột; 19-20: Ngô đóng hộp; 21-22: Bột ngũ cốc; 23: ĐC (+); 24: ĐC (-)
Kết quả trong hình 1 cho thấy, phương pháp 
phenol/chlorofom tách chiết ADN không thành 
công, ADN bị đứt gãy, lượng ADN thu được tương 
đối ít, sản phẩm ADN thu được là các vạch mờ, hoặc 
dải dài, không thành băng vạch rõ ràng và cùng kích 
thước vị trí với λADN chuẩn. Phần băng sáng nhỏ 
ở phía trước dải màu chất nhuộm là các sản phẩm 
ARN và các tạp chất còn lại chứ không phải là ADN. 
Trong quá trình tách chiết, ARN cần được xử lý thêm 
để loại bỏ hoàn toàn ra khỏi sản phẩm tách ADN. 
Vậy phương pháp này không thích hợp để tách chiết 
tinh sạch ADN có nguồn gốc từ các sản phẩm nền 
mẫu đã bao gồm trong nghiên cứu này.
Trong hình 2, có thể nhận thấy ADN thu được ít, 
có ADN bị đứt gãy, vạch không sáng rõ, khá mờ, còn 
lẫn nhiều tạp chất. Chỉ tách được ADN của các mẫu 
hạt ngô và hạt đậu tương. Mẫu 1 (giếng 1, 2) tách 
chiết ADN chấp nhận được, lẫn tạp ít. Mẫu 2 (giếng 
3, 4) tách chiết ADN chấp nhận được. Mẫu 4 (giếng 
7, 8), mẫu 8 (giếng 15, 16) và mẫu 11 (giếng 21, 22) 
có ADN nhưng bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ. 
Các mẫu còn lại tách chiết không thành công.
Phía dưới của hình 2, vẫn thấy một số mẫu có 
vạch sáng như giếng số 3-4; 9-10; 15-16; 21-22; 24. 
Đó không phải là ADN mà chính là ARN và các 
tạp chất khác chưa được xử lý hết trong quá trình 
tách chiết. 
70
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(82)/2017
Từ kết quả trên hình 4 cho thấy phương pháp sử 
dụng kit Wizard ADN clean-up systemcủa Promega 
tách chiết ADN rất thành công. ADN không bị đứt 
gãy, các vạch ADN đều sáng rõ, ngoài ra đều không 
bị lẫn các tạp chất như protein hay ARN do không bị 
tạo thành các vệt sáng trên gel điện di. Vậy phương 
pháp này thích hợp để tách chiết tinh sạch ADN có 
nguồn gốc đa dạng từ các mẫu hạt (hạt đậu tương, 
hạt ngô), đến các mẫu chứa nhiều hỗn hợp các loại 
ADN (thức ăn chăn nuôi), đến các sản phẩm chế 
biến (sữa đậu nành, sữa bột, bim bim, bột đậu, bột 
ngũ cốc, ngô đóng hộp). 
So sánh về tính hiệu quả của 4 phương pháp 
được khảo sát cho thấy, phương pháp tách chiết 
ADN bằng phenol/chloroform và PVP cho hiệu quả 
thấp. Phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB thu 
được ADN nồng độ và chất lượng tốt. Phương pháp 
sử dụng kit Wizard ADN clean-up system dễ thao 
tác, thời gian tách nhanh và cho ADN chất lượng 
cao, nhưng giá thành tương đối cao. Tuy nhiên, khi 
tách ADN cho phát hiện biến đổi gen, nếu chỉ kiểm 
tra bằng PCR thường, thì chỉ cần tách chiết bằng 
phương pháp CTAB là đủ (Amd.1:2013). Nhưng khi 
kiểm tra định tính, định lượng bằng phương pháp 
Real time PCR, thì việc sử dụng kit Wizard ADN 
clean-up system tách chiết ADN là cần thiết để đạt 
được ADN tinh sạch, đảm bảo chất lượng kết quả 
thử nghiệm.
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- Phương pháp tách chiết ADN bằng phenol/
chloroform không phù hợp để tách chiết các nền 
mẫu nghiên cứu.
- Phương pháp tách chiết ADN bằng PVP chỉ phù 
hợp để tách chiết các nền mẫu hạt (đậu tương hạt).
- Phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB thích 
hợp dùng để tách chiết ADN tinh sạch từ 5 nền mẫu 
nghiên cứu,cho nồng độ đạt từ 40,5 ng/µl đến 184,4 
ng/µl, chỉ số A260/280 đạt từ 1,68 đến 2,27.
- Phương pháp sử dụng bộ kit (Wizard ADN 
clean-up system) của Promega thích hợp dùng để 
tách chiết ADN tinh sạch từ 5 nền mẫu nghiên cứu, 
cho nồng độ đạt từ 82,8 ng/µl đến 184,4 ng/µl, chỉ số 
A260/280 trong khoảng từ 1,8 đến 2,07.
- Hai phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB 
và tách chiết ADN bằng bộ kit (Wizard ADN clean-
up system) của Promega có thể được sử dụng trong 
các phòng thí nghiệm cho mục đích phát hiện biến 
đổi gen đối với 5 nền mẫu hạt, bột, nước, thức ăn 
chăn nuôi và thực phẩm.
Hình 3 cho thấy ADN không bị đứt gãy, các vạch 
ADN đều sáng rõ, không bị lẫn các tạp chất như 
protein hay ARN do không bị tạo thành các vệt sáng. 
Alpha-amylaza được cho vào dung dịch đệm phân 
giải đã thủy phân các tinh bột khi các chất nền chứa 
nhiều tinh bột. Việc xử lí mẫu bằng proteinase K là 
cần thiết đối với nhiều loại chất nền khi việc kết tủa 
đồng thời ARN có thể làm nhiễu phép phân tích tiếp 
theo. Nồng độ muối trong suốt quá trình tách chiết 
là rất quan trọng trong việc loại bỏ các tạp chất, vì sự 
kết tủa của axit CTAB-nucleic sẽ xảy ra nếu nồng độ 
muối giảm xuống thấp khoảng 0,5 mol/l ở nhiệt độ 
phòng và/hoặc nếu nhiệt độ giảm xuống dưới 16oC. 
Bằng cách tăng nồng độ muối lên đến 1,4 mol/l, việc 
loại bỏ các protein đã biến tính và polysacarit được 
tạo phức với CTAB sẽ xảy ra, lúc đó axit nucleic 
được hòa tan và dễ dàng thu lại ở bước tủa cuối cùng 
bằng Isopropanol và ethanol. Như vậy, khi so sánh 3 
phương pháp tách chiết ADN thông thường, chỉ có 
phương pháp tách chiết bằng CTAB theo đúng như 
TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) dùng để tách 
chiết được ADN từ hầu hết các loại chất nền từ các 
mẫu hạt (hạt đậu tương, hạt ngô), đến các mẫu chứa 
nhiều hỗn hợp các loại ADN (thức ăn chăn nuôi), 
đến các sản phẩm chế biến (sữa đậu nành, sữa bột, 
bim bim, bột đậu, bột ngũ cốc, ngô đóng hộp).
Hình 4. Kết quả điện di ADN trên gel agarose 0,8% 
đối với phương pháp sử dụng bộ kit Wizard ADN clean-up system của Promega
Giếng M: marker λ ADN chuẩn nồng độ 200 ng; 1-2: Hạt ngô; 3-4: Hạt đậu tương; 5-6: TACN C20 Con cò; 
7-8: TACN554 Higro; 9-10: TACN VH20S; 11-12: Bim bim Ostar; 13-14: Sữa đậu nành Fami; 15-16: Bột đậu xanh 
Rồng Vàng; 17-18: Sữa bột; 19-20: Ngô đóng hộp; 21-22: Bột ngũ cốc; 23: ĐC (+); 24: ĐC (-)

File đính kèm:

  • pdftham_dinh_mot_so_phuong_phap_tach_chiet_adn_cho_phat_hien_bi.pdf