Phân tích hàm lượng Vitamin A trong một số loại ngũ cốc chế biến ở thành phố Huế và một số vùng lân cận bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

 96 
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC 
CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG LÂN CẬN BẰNG 
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
Đến tòa soạn 27 - 06 - 2016 
Ngô Văn Tứ, Lê Thị Nhƣ Ngọc 
Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế 
SUMMARY 
DETERMINATION OF VITAMIN A CONTENTS OF PROCESSED CEREALS 
IN HUE CITY AND NEARLY AREAS BY HIGH PERFORMANCE 
LIQUID CHROMATOGRAPHY 
In this paper, we report the result of research and development analytical methods of vitamin A 
in processed cereals by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detecter 
(RF). The research results show tat the determination is measured at 348 nm/370 nm wavelength, 
reversed phase C18 column (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), at room temperature, mobile phase: MeOH: 
H2O (90:10 by volume), 20 L sample injection volume, flow rate 0.8 mL/min. The highly sensitive 
method good repeatability (RSD% < 2%, n = 8), low detection limit, LOD = 0.003 ppm. Between the 
concentration of vitamin A and peak area with good linear correlation in the range 0.05 ÷ 10.00 ppm 
with R
2
 = 0.9998. Results of quality control methods on real samples showed that the method has a 
good right to withdraw from the 96 ÷ 101%. 
1 MỞ ĐẦU 
Vitamin l m t nhóm chất hữu cơ có ph n tử lƣợng tƣơng đối nhỏ v có ản chất 
hoá học rất khác nhau, l nhóm chất rất cần thiết cho ho t đ ng sống của các cơ thể sinh 
vật Vitamin A rất cần thiết cho sự sinh trƣởng v phát triển xƣơng ở trẻ em, cho sự 
nhìn thấy (cụ thể trong ánh sáng ho ng h n), cho sự nguyên vẹn ề m t iểu m v 
niêm m c Thiếu vitamin A có thể g y ra ệnh quáng g , kh mắt, nhuyễn giác m c v 
có thể g y m , đ c iệt ở trẻ em Ngo i ra, vitamin A c n có tác ụng chống ung thƣ 
chống l o hóa [1 , [2 
Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 21, Số 4/2016 
 97 
Tuy nhiên do Vitamin A hòa tan trong m mỡ, việc thải lƣợng ƣ thừa từ ăn uống 
l khó khăn hơn so v i các vitamin tan trong nƣ c Do vậy quá liều có thể ẫn đến ng 
đ c Vitamin A Nó có thể g y uồn n n, v ng a, ị ứng, chứng iếng ăn, n n mửa, 
nhìn mờ, đau đầu, tổn thƣơng cơ v ụng, uể oải v thay đổi tính tình [1 
Trên thế gi i đ có nhiều c ng trình nghiên cứu về vitamin A[5 trong thực phẩm 
[8 , trong sữa tƣơi [9 , trứng, c rốt, ngũ cốc ằng nhiều phƣơng pháp ph n tích c ng 
cụ khác nhau nhƣ quang phổ hấp thụ ph n tử UV – Vis, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu 
năng cao (HPLC) Nhƣng ở Việt Nam việc nghiên cứu xác định h m lƣợng vitamin A 
trong ngũ cốc c n h n chế, vẫn chƣa đƣợc quan t m đ ng mức 
B i áo n y trình y các kết quả nghiên cứu xác định h m lƣợng vitamin A trong 
các mẫu ngũ cốc chế iến ằng HPLC, từ đó đƣa ra điều kiện thích hợp để tiến h nh 
ph n tích vitamin A trong các lo i ngũ cốc chế iến trên địa n th nh phố Huế v m t 
số v ng l n cận 
2 THỰC NGHIỆM 
2.1. Hóa chất và thuốc thử 
Tất cả hóa chất đều l lo i tinh khiết ph n tích của h ng Merck: etanol 95%, axit 
acro ic, axit axetic, THF Tetrahyđrofuran, metanol, hexan 
THF- ethanol (50+50) – ( 50mL tetrahyđrofuran v 50mL ethanol 95% ) 
Kali hyđroxit 50%: thêm từ từ 500g KOH t viên v o 500ml nƣ c chứa trong 
 ình có thể tích 1L 
Chất chuẩn: B y tế, viện kiểm nghiệm TPHCM, chất chuẩn đối chiếu: Retinyl 
palmitate C20H30O, số l : QT 041:081111, h m lƣợng: 1051600 IU/g 
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của h ng Shima zu, Nhật Bản; c t sắc 
ký C18 (150 x 4,5 mm, 5 μm) của h ng GL Sciences Inc, Nhật Bản 
B lọc h t ch n kh ng của h ng Gast, Mỹ Thiết ị lọc nƣ c siêu s ch của h ng 
Barnstead International, USA Tủ sấy của h ng Memmert M ng lọc 0,45 μm của h ng 
Sartorius Ste im, Đức 
2.2. Tiến trình phân tích 
Xử lý mẫu theo AOAC 2001 13, đƣợc tóm tắt trong hình 2 1 Mẫu chuẩn v mẫu 
ph n tích đƣợc x ph ng hóa ằng KOH trong nƣ c, trung h a, pha lo ng chuyển đổi 
chất éo th nh các axit éo v este retinol [3] 
 98 
Hình 2.1. Sơ đồ xử lý mẫu 
Retinol đƣợc định lƣợng ằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 
v i etector RF phát hiện ở ƣ c sóng kích thích v phát x l 348 nm/470 nm, c t pha 
đảo C18. 
Điều kiện sắc ký: nhiệt đ ph ng, pha đ ng l MeOH : H2O (90: 10), thể tích tiêm 
mẫu 20 μL, tốc đ ng: 0,8 mL/phút, thời gian lƣu 5,7 ph t, ghi l i sắc ký đồ của mẫu 
chuẩn v mẫu ph n tích 
Nồng đ vitamin đƣợc tính ằng cách so sánh iện tích pic của vitamin trong các 
mẫu ph n tích v i những mẫu tiêu chuẩn 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Theo [4 để phát hiện v định lƣợng vitamin A sử ụng etector RF ƣ c sóng 
kích thích v phát x đƣợc lựa chọn l (Ex/Em) 348 nm/470 nm, chúng tôi cũng chọn 
 ƣ c sóng n y để nghiên cứu 
3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pha động 
Th nh phần pha đ ng đƣợc khảo sát ao gồm: methanol (MeOH): nƣ c (H2O). 
Ch ng t i tiến h nh khảo sát các tỷ lệ pha đ ng methanol : nƣ c = (70:30); methanol : 
nƣ c = (90:10); v i ung ịch chuẩn vitamin A có nồng đ 5 ppm, tốc đ ng 1 
mL/phút; Vtiêm = 20µL, kết quả thu đƣợc ở ảng 3 1 
Bảng 3.1. Hệ số đối xứng peak với các tỷ lệ về dung môi pha động 
Ký hiệu Hệ dung môi Tỷ lệ pha động Hệ số đối xứng 
(a) Methanol : nƣ c 70 : 30 1,600 
(b) Methanol : nƣ c 90 : 10 1,118 
Dung ịch ph n tích 
L m l nh nhanh 
Lọc qua m ng 0,45 µm Để qua đêm 
X ph ng hóa ằng 10 mL KOH 50%, đun hồi 
lƣu 45 ph t 
Cho 10 mL axit axetic, pha lo ng ằng ethanol 
95% : THF (50 : 50) đến 100 mL 
20 – 30 g mẫu + 50 mg axit acrobic + 
 40 mL ethanol 95%. 
Sau 10 ph t lắc tr n ình 
Mẫu ngũ cốc 
 99 
Từ kết quả khảo sát cho phép ch ng t i chọn hệ ung m i pha đ ng methanol : 
nƣ c v i tỉ lệ thể tích l 90 : 10 
3.2. Khảo sát tốc độ dòng 
Tiến h nh khảo sát trên hệ ung m i pha đ ng methanol : nƣ c (90:10), v i các 
tốc đ ng 1,0 mL/phút; 0,8 mL/phút và 0,5 mL/phút Kết quả đƣợc thể hiện qua các 
hình 3.1 a, b, c v ảng 3 2 
 (a) (b) 
(c) 
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hệ pha động methanol : nước=(90:10) 
 với cáctốc độ : a. 1,2 mL/ph; b. 0,5 mL/ph; c. 0,8 mL/ph 
Bảng 3.2. Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau (n=5) 
 Tốc đ ng 
 ( mL/phút) 
Các th ng số 
1,2 
(a) 
0,8 
(c) 
0,5 
(b) 
Thời gian lƣu tR 
Hệ số đối xứng Sa 
3,586 
1,111 
5,761 
1,072 
7,952 
1,725 
Từ các sắc đồ cho thấy, trƣờng hợp (c) có pic ph n tích xuất hiện ở khoảng thời 
gian không quá dài (5,7 phút), hiệu quả tách tốt, pic thu đƣợc c n đối, nhọn đẹp, có 
cƣờng đ tín hiệu cao 
Qua kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách sắc ký, ch ng t i đ 
lựa chọn đƣợc điều kiện thích hợp để định lƣợng vitamin A ằng phƣơng pháp HPLC v i 
 100 
c t C18, ƣ c sóng kích thích v phát x 348 nm/470 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL, sử 
 ụng hệ pha đ ng methanol : nƣ c = (90:10), tốc đ ng 0,8 mL/ph t để khảo sát các 
n i ung tiếp theo 
3.3. Tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký 
Tiến h nh tiêm 6 lần mẫu v o hệ thống sắc ký HPLC ở điều kiện đ chọn v ghi 
 iện tích pic thu đƣợc Đ ổn định của hệ thống sắc ký đƣợc iểu thị ằng sai số tƣơng 
đối (RSD%) của kết quả sau 6 lần tiêm mẫu Kết quả đƣợc trình y ở ảng 3 3 
Bảng 3.3. Các thông số sắc ký của pic vitamin A 
Hoạt chất Lần đo 
Thời gian lƣu 
(tR) 
Diện tích pic Hệ số đuôi 
Vitamin A 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
5,790 
5,787 
5,804 
5,823 
5,836 
5,849 
1184794 
1191545 
1197186 
1203233 
1210824 
1217100 
1,041 
1,037 
1,038 
1,040 
1,035 
1,035 
TB 
RSD (%) 
5,815 
0,434 
1200780 
1,004 
1,038 
0,241 
ĐKSK: Cột C18, Detector RF, bước sóng kích thích và phát hiện 348 nm/470 nm, tốc 
độ dòng 0,8 mL/phút, dung môi pha động là MeOH : H2O = 90 : 10, thể tích tiêm 20 μL. 
Nhận xét: 
- Thời gian lƣu trung ình của pic vitamin A là 5,815 (RSD% = 0,434%) là 
khoảng thời gian thích hợp cho quá trình ph n tích sắc ký 
- Diện tích trung ình của pic vitamin A l 1200780 (RSD% = 1,004%)Những kết 
quả trên cho thấy quy trình sắc ký m ch ng t i x y ựng l ph hợp v đảm ảo sự ổn 
định cho quá trình định lƣợng vitamin A. [5] 
3.4. Thẩm định phƣơng pháp xây dựng đƣợc 
3.4.1. Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 
Chuẩn ị y ung ịch chuẩn vitamin A có nồng đ thay đổi trong khoảng 0,05 
 10 ppm để khảo sát khoảng tuyến tính 
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 
Nồng đ C (ppm) 0,05 0,1 0,5 1 5 10 
Diện tích peak (S) 13174 23960 114074 226528 1082888 2105965 
Từ kết quả thí nghiệm, x y ung đƣợc khoảng tuyến tính nhƣ sau: 
y = 210638x + 9910,7 
 101 
0 2 4 6 8 10 12
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
y = 210638x + 9910,7
R
2
 = 0,9998
S
C (ppm) 
Hình 3.2. Đường hồi quy tuyến tính. 
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng đ các chất ph n tích v iện tích 
pic có mối liên quan ch t chẽ, hệ số tƣơng quan R2 = 0,9998 trong khoảng nồng đ 0,05 
÷ 10 ppm. 
3.4.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 
 Gi i h n phát hiện (LOD) của phƣơng pháp đƣợc xác định theo qui tắc 3ζ và áp 
 ụng hồi qui tuyến tính [10 Đƣờng hồi qui tuyến tính đƣợc x y ựng trong khoảng hẹp 
của nồng đ gần gốc tọa đ (0,05 ÷ 1,00 ppm) Kết quả đƣợc trình y ở ảng 3 5 
Bảng 3.5. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) 
Nồng đ (ppm ) 0,05 0,10 0,50 1,00 
Diện tích peak 13174 23960 114074 226528 
Phƣơng trình hồi qui 224797x + 1705,3 
LOD = 0,003 ppm và LOQ = 0,099ppm 
3.4.3. Xác định độ lặp lại của phương pháp 
Để kh ng định khả năng áp ụng phƣơng pháp HPLC v o ph n tích h m lƣợng 
vitamin A trong mẫu thực tế, cần đánh giá qua đ l p l i v đ đ ng 
Kết quả khảo sát đ l p l i của phƣơng pháp ph n tích ằng cách tiến h nh ph n 
tích l p l i 8 lần trên c ng m t mẫu chất. Lấy 30 g mẫu ngũ cốc chế iến có h m lƣợng 
0,478 ppm/100g, tiến h nh xử lý theo sơ đồ 2.1 Kết quả đƣợc trình y ở ảng 3 6 
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu ngũ cốc 
Diện tích 108333,875 
Nồng độ (ppm) 0,467 
RSD (%) 2,347 
½.RSDHorwitz 8,935 
Kết quả ở ảng 3 6 cho thấy: phƣơng pháp đ t đƣợc đ l p l i tốtqua 8 lần ph n 
tích Ngƣời ta thừa nhận, khi xác định những nồng đ C ất kỳ nếu đ t đƣợc RSD 
kh ng vƣợt quá 0,5 RSDHorwitz l đ t yêu cầu (RSDHorwitz l đ lệch chuẩn tƣơng đối tính 
 102 
toán đƣợc từ phƣơng trình Horwitz: RSDHorwitz = 2
1-0,5logC
 v i C l nồng đ iễu iễn ằng 
ph n số [7 , [10 Nhƣ vậy, cỡ nồng đ 0,478 ppm nếu RSD 8,9% l đ t yêu cầu 
3.4.4. Xác định độ đúng của phương pháp 
Phƣơng pháp HPLC cũng đ t đ đ ng tốt khi ph n tích mẫu thêm chuẩn v i đ 
thu hồi từ 91 ÷ 100%. 
Đ đ ng đƣợc xác định ằng phƣơng pháp thêm chuẩn Tiến h nh thêm ở a mức 
0,400 ppm; 0,500 ppm; 0,600 ppm chất chuẩn vitamin A v o v o mẫu ngũ cốc chế iến 
có nồng đ n đầu 0,478 ppm, ứng v i m i mức thêm, làm 3 thí nghiệm đo kết quả a 
lần lấy giá trị trung ình Kết quả đƣợc trình y trong ảng 3 7. 
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu ngũ cốc chế biến (n=3) 
Mẫu 
Nồng đ 
 an đầu 
 Co (ppm) 
Nồng đ 
thêm vào 
C1 (ppm) 
Nồng đ 
tìm thấy 
C2(ppm) 
Tỷ lệ thu 
hồi Rev 
(%) 
1/2.RSDHorwitz 
(%) 
Kiểm 
tra 
1 
0,478 
0,400 0,886 100,90 9,18 Đ t 
2 0,500 0,957 97,85 8,88 Đ t 
3 0,600 1,035 96,01 8,64 Đ t 
Kết quả ở ảng 3 7 cho thấy: phƣơng pháp đ t đƣợc đ đ ng tốt v i đ thu hồi 
nằm trong khoảng từ 96% - 101%, thỏa m n h m Horwitz Chứng tỏ phƣơng pháp phân 
tích x y ựng l ho n to n ph hợp để định lƣợng vitamin A trong mẫu sữa [10 
3.5. Xác định hàm lƣợng vitamin A trong các mẫu ngũ cốc trên địa bàn thành phố 
Huế và các vùng lân cận 
Qua khảo sát 05 mẫu ngũ cốc ch ng t i thu đƣợc kết quả h m lƣợng vitamin A đƣợc 
trình y nhƣ trong ảng 3 8 
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong 05 mẫu ngũ cốc chế biến. 
TT Tên mẫu 
Kết quả Hàm lƣợng trên bao bì 
Vitamin A (UI/100g) Vitamin A (UI/100g) 
1 Sữa v yến m ch 
529,41 11,46 
379 - 568 
2 Ngũ cốc inh ƣỡng ia et 
1480,46 20,59 
1200 
3 Nutifood 
981,93 3,87 
820 
4 Nestle 
1681,55 19,38 
1610 
5 Quasure light 
1191,81 18,14 
1167 
 103 
Nhận xét: Từ kết quả ph n tích 05 mẫu ngũ cốc chế iến ch ng t i nhận thấy 100% sản 
phẩm ngũ cốc chế iến đều chứa vitamin A ở h m lƣợng gần v i h m lƣợng ghi trên ao ì 
sản phẩm m nh sản xuất đ c ng ố H m lƣợng vitamin A trong mẫu ngũ cốc từ 529 - 
1681 UI/100g. 
4 KẾT LUẬN 
 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử ụng ph n tích h m lƣợng vitamin A 
trong các mẫu ngũ cốc l phƣơng pháp có đ nh y cao, gi i h n định lƣợng (LOQ) v 
gi i h n phát hiện (theo quy tắc 3) LOD = 0,003 ppm, LOQ = 0,099 ppm; giữa nồng 
đ vitamin A v iện tích pic có tƣơng quan tuyến tính tốt trong khoảng 0,05 ÷ 10 ppm 
v i R2 = 0,9998. 
Kết quả kiểm tra chất lƣợng của phƣơng pháp trên mẫu thực tế cho thấy 
phƣơng pháp đ t đƣợc đ l p l i tốt v i RSD% < 2%, n = 8, đ đ ng tốt v i đ thu 
hồi từ 96 ÷ 101%. 
Có thể sử ụng quy trình ph n tích n y để xác định h m lƣợng vitamin A trong 
các mẫu ngũ cốc Kết quả ph n tích 5 mẫu ngũ cốc có ổ sung vitamin A, ch ng t i 
nhận thấy 100% sản phẩm có h m lƣợng vitamin A gần đ ng h m lƣợng ghi trên ao ì 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Phan Đình Ch u, Hóa dược và kỹ thuật tổng hợp 1, NXB Khoa học v kỹ thuật 
[2 Hóa ƣợc - ƣợc lý, sách đào tạo dược sĩ trung học, NXB Y học 
[3] AOAC official method 2001.13, Determination of Vitamin A (retinol) in Foods by Liquid 
Chromatography First Action 2001. 
[4] Collins CA, Chow CK (1984), “Determination of vitamin A an vitamin A acetate y high-
performance liqui chromatography with fluorescence etection”,  
1984 December 28. 
[5] Dennis Eriksen(2008), Vitamin A determination by HPLC, Code: 10002-01. 
[6] H. Faulkner, A. Hussein, M. Foran, and L. Szijarto, A Survey of Vitamin A and D Contents 
of Fortified Fluid Milk in Ontario, Laboratory Services Division, University of Guelph, 
Guelph, ON, Canada N1H 8J7, Journal of Dairy Science Vol. 83, No. 6, 2000 
[7] Horwitz W., Albert R., The Concept of Uncertainty as Applied to Chemical Measurement, 
Analyst 122, (1997), 615-617. 
 [8] Jonathan W. Devries and Karlene R. Silvera (2002), Determination of Vitamins A (Retinol) 
and E (alpha-Tocopherol) in Foods by Liquid Chromatography: Collaborative Study. 
[9] Manuela Strobel, Felix Heinrich, Hans K. Biesalski (2000), Improved method for rapid 
determination of vitamin A in small samples of breast milk by high-performance liquid 
chromatography, Department of Biological Chemistry and Nutrition, University of 
Hohenheim, Fruwirthstrasse 12, D-70593 Stuttgart, Germany. 
 [10] Miller J. C. and Miller J. N. (1988), Statistics For Analytical Chemistry- second edition, 
Ellis Horwood Limited, John Wiley and Sons, England.