Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học tạo ra bởi chủng vi khuẩn phân lập từ đất nhiễm dầu ở Vũng Tàu

Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học 
 102 
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL CỦA MÀNG SINH HỌC TẠO RA BỞI CHỦNG 
VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT NHIỄM DẦU Ở VŨNG TÀU 
Lê Thị Nhi Công1*, Trịnh Thành Trung2, Cung Thị Ngọc Mai1, Đỗ Thị Tố Uyên1 
1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *lenhicong@ibt.ac.vn 
2Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 
TÓM TẮT: Phenol và các hợp chất có chứa nhóm phenol là các chất gây ô nhiễm môi trường khá 
phổ biến trong nước thải nhiễm dầu của các khu khai thác dầu khí và các trạm xăng dầu. Để xử lý 
các hợp chất này, sử dụng vi sinh vật tạo màng sinh học đang là một trong những hướng đi mới 
hiện nay. Từ các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu diesel và một số hợp chất hydrocarbon 
có trong dầu mỏ, chúng tôi đã lựa chọn được chủng vi khuẩn VTPG5 vừa có khả năng tạo màng 
sinh học vừa có khả năng phân hủy phenol cao. Chủng này đã được phân loại bằng việc xác định 
trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA và được đặt tên là Rhodococcus sp.VTPG5. Trình tự đoạn gen 
này đã được đăng ký trên ngân hàng NCBI với mã số là LC057207. Chủng VTPG5 được xác định 
là có khả năng tạo màng tốt nhất ở nhiệt độ 37oC, pH 7, nồng độ muối NaCl là 1,5% (w/v), nguồn 
cacbon là glucose, nguồn nitơ là (NH4)2SO4. Sử dụng các điều kiện tối ưu này để tạo màng sinh 
học nhằm đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng tạo thành, kết quả cho thấy hiệu suất phân 
hủy của màng sinh học chủng VTPG5 là 99,8% sau 7 ngày nuôi cấy với hàm lượng phenol ban đầu 
là 200 mg/l. Kết quả này mở ra hướng ứng dụng màng sinh học của chủng VTPG5 trong xử lý 
nước ô nhiễm phenol và các hợp chất có chứa nhóm phenol. 
Từ khóa: Rhodococcus, màng sinh học, nước nhiễm dầu, phenol, phân hủy sinh học. 
MỞ ĐẦU 
Hiện nay, do nhu cầu sử dụng dầu mỏ và 
các sản phẩm dầu mỏ trên thế giới ngày càng 
tăng nên không tránh khỏi các vấn đề ô nhiễm 
môi trường ở các mức độ khác nhau. Thành 
phần chủ yếu của dầu mỏ gây ô nhiễm môi 
trường là hydrocarbon no, hydrocarbon thơm 
đơn nhân và đa nhân [ 12]. Trong các hợp chất ô 
nhiễm đó, phenol là một hợp chất hữu cơ khó 
phân hủy và rất độc hại [ 4]. Vì vậy, việc xử lý 
phenol trong nước ô nhiễm dầu đặc biệt được 
chú trọng. 
Trên thế giới, công nghệ màng sinh học đã 
được áp dụng trong nhiều lĩnh vực xử lý ô 
nhiễm môi trường [ 3]. Tuy nhiên, chưa có nhiều 
công bố về ứng dụng công nghệ màng sinh học 
để xử lý phenol. Công nghệ màng sinh học đã 
chứng minh có khá nhiều ưu điểm như: giá 
thành thấp, ít sử dụng hóa chất, thiết kế linh 
động, thích nghi với mọi loại hình công nghiệp 
và diện tích xử lý [ 3]. Đặc biệt màng sinh học từ 
vi sinh vật tạo thành cho thấy có khả năng xử lý 
các hợp chất hydrocarbon thơm trong đó có 
phenol rất tốt [ 4]. 
Với một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, 
Việt Nam có khu hệ vi sinh vật tương đối đa 
dạng, đặc biệt là môi trường nước. Trong môi 
trường biển, vi khuẩn phân hủy hydrocacbon 
chiếm ưu thế, phân bố ngay cả ở trong vùng cực 
lạnh [ 10]. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành tuyển 
chọn chủng vi khuẩn vừa có khả năng tạo màng 
sinh học vừa có khả năng phân hủy phenol cao 
từ tập đoàn vi sinh vật đã được phân lập từ nước 
nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu. Từ đó, đánh giá 
khả năng phân hủy phenol của màng sinh học 
chủng vi khuẩn này. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Chín chủng vi khuẩn được phân lập từ các 
mẫu đất nhiễm dầu lấy ở bờ biển Vũng Tàu. 
Tạo màng sinh học 
Để đánh giá khả năng tạo màng sinh học của 
các chủng vi khuẩn, phương pháp của Morikawa 
et al. (2006) [ 8] đã được sử dụng bằng cách đưa 
chủng nuôi cấy non vào môi trường đặc hiệu. 
Sau 2 ngày, màng sinh học tạo thành sẽ được rửa 
bằng nước cất và nhuộm với dung dịch tím. 
Màng hình thành này sẽ được rửa lại bằng 
TAP CHI SINH HOC 2016, 38(1): 102-108 
 DOI: 10.15625/0866-7160/v38n1.7060 
Le Thi Nhi Cong et al. 
 103 
DMSO và đo ở bước sóng 570 nm. Các chủng có 
mật độ quang học cao sẽ được lựa chọn. 
Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển 
của các chủng vi khuẩn trên nguồn cơ chất 
phenol 
Các chủng vi khuẩn được nuôi lắc trên môi 
trường khoáng có bổ sung các nồng độ phenol 
khác nhau ở 30oC. Sau 1, 3, 5 và 7 ngày dịch 
nuôi cấy được lấy ra và đo ở bước sóng 600 nm. 
Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi 
điện tử quét 
Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn đã 
được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét 
S4800, Hitachi, Nhật Bản với độ phóng đại 
15.000 lần. Quá trình này được thực hiện với sự 
phối hợp của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. 
Phân loại định tên vi khuẩn dựa trên so sánh 
trình tự 16S rRNA 
DNA tổng số của chủng vi khuẩn VTPG5 
được tách chiết theo mô tả của Zhou et al. 
(1996) [ 13] và được dùng làm khuôn để khuếch 
đại gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 9f (5'-
GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3') và 
1525r (5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG 
CC-3'). Chu trình phản ứng: 94oC trong 5 phút; 
lặp lại 35 chu kỳ (94oC trong 30 giây; 56oC 
trong 30 giây; 72oC trong 2 phút); 72oC trong 5 
phút và 4oC để bảo quản. Tiếp đó sản phẩm 
PCR (kích thước khoảng 1500 bp) được tinh 
sạch và xác định trình tự trên máy xác định trình 
tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic 
Analyzer, Hoa Kỳ. Việc so sánh trình tự 
nucletide và xây dựng cây phát sinh chủng loại 
của chủng vi khuẩn đại diện với các chủng vi 
khuẩn có trên ngân hàng Genbank (NCBI) sử 
dụng chương trình Blast, phần mềm Bioedit, 
Clustal X và Mega4. 
Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện 
sinh lý, sinh hóa lên khả năng tạo màng sinh 
học của chủng vi khuẩn 
Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên 
khả năng hình thành màng sinh học của các 
chủng vi khuẩn được tiến hành trong môi 
trường hiếu khí tổng số với các nhiệt độ thí 
nghiệm từ 25oC đến 50oC; pH từ 4 đến 9; nồng 
độ NaCl từ 0,5 đến 4% (w/v), các nguồn carbon 
được sử dụng bao gồm: glucose, lactose, 
saccarose, mantose và các nguồn nitơ được sử 
dụng bao gồm: NaNO3, KNO3, pepton và cao 
nấm men. 
Nghiên cứu khả năng phân hủy phenol của vi 
khuẩn 
Chủng vi khuẩn VTPG5 được nuôi lắc trên 
môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung cơ 
chất phenol được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 
30oC. Khả năng phân hủy phenol của chủng vi 
khuẩn được xác bằng phương pháp đo quang 
theo Standrard method SMEWW 5530 C 
(Choloroform Extraction Method). Tương 
đương với tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 
6216:1996 (ISO 6439-1990), phương pháp trắc 
phổ dùng 4-aminoantipyrin. Quá trình phân tích 
phenol được thực hiện với sự phối hợp của Viện 
Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ 
Việt Nam. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Tuyển chọn chủng vi khuẩn vừa có khả 
năng tạo màng sinh học vừa có khả năng phân 
hủy phenol cao 
Từ 9 chủng vi khuẩn được phân lập từ các 
mẫu đất nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, chúng 
tôi đã tiến hành đánh giá khả năng tạo màng 
sinh học của các chủng vi khuẩn. Trong 9 chủng 
vi khuẩn phân lập được có 5 chủng là VTPG1, 
VTPG2, VTPG3, VTPG4 và VTPG5 có khả 
năng tạo màng tốt nhất (độ hấp thụ tím tinh thể 
tại bước sóng 570 nm là cao nhất). Tiếp tục 
khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của 
5 chủng vi khuẩn đó trên môi trường có bổ sung 
50 ppm phenol, 0,1% glucose. 
Hình 1 và hình 2 cho thấy, chủng vi khuẩn 
VTPG5 vừa có khả năng tạo màng vừa có khả 
năng sinh trưởng, phát triển tốt trong môi 
trường có chứa 50 ppm phenol. Vì vậy, chúng 
tôi chọn chủng vi khuẩn VTPG5 để tiến hành 
các nghiên cứu tiếp theo. 
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế 
bào của chủng vi khuẩn VTPG5 
Khuẩn lạc chủng VTPG5 có màu cam, tròn, 
lồi, bóng ướt, có viền trắng trong xung quanh, 
D: 0,5-1 mm. Chủng VTPG5 là vi khuẩn Gram 
dương. Dưới độ phóng đại 20.000 lần, tế bào có 
hình que ngắn, kích thước (1,1-1,2) µm × (0,81-
0,98) µm (hình 3). 
Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học 
 104 
Hình 1. Khả năng tạo màng sinh học của các 
chủng vi khuẩn 
Hình 2. Khả năng sinh trưởng của các chủng 
VKtrong môi trường có bổ sung phenol 
Hình 3. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng vi khuẩn VTPG5 
Phân loại chủng VTPG5 bằng việc xác định 
trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 
Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của 
chủng vi khuẩn VTPG5 được xác định trực tiếp 
từ sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu 
là 9f và 1525r tương đồng tới 99% với các 
chủng thuộc chi Rhodococcus. Vì vậy, chủng 
VTPG5 được đặt tên là Rhodococcus 
sp.VTPG5. Trình tự đoạn gen này đã được đăng 
ký trên ngân hàng DDBJ với mã số là 
LC057207. Cây phát sinh chủng loại của chủng 
Rhodococcus sp. VTPG5 được chỉ ra ở hình 4. 
Hình 4. Cây phát sinh chủng loại của chủng Rhodococcus sp.VTPG5 
A B 
Le Thi Nhi Cong et al. 
 105 
Hiện nay, đã có nhiều bài báo đề cập đến 
khả năng phân hủy phenol của các chủng vi 
khuẩn tạo màng sinh học thuộc chi 
Rhodococcus, vì vậy, nghiên cứu này của chúng 
tôi bổ sung thêm vào bộ sưu tập các chủng vi 
khuẩn vừa có khả năng tạo màng, vừa có khả 
năng phân hủy phenol được phân lập tại nước ô 
nhiễm dầu bờ biển Việt Nam. 
Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự 
hình thành biofilm của chủng VTPG5 
Tại thời điểm 48 giờ, khả năng tạo màng 
sinh học của chủng vi khuẩn VTPG5 đã được 
xác định là tốt nhất ở nhiệt độ 37oC, pH 7, nồng 
độ muối NaCl 1,5%, nguồn cacbon là glucose, 
nguồn nitơ là (NH4)2SO4 (hình 5). 
Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ (a), pH (b), 
nồng độ muối NaCl (c), nguồn carbon (d), 
nguồn nitơ (e) đến khả năng tạo màng sinh 
học của chủng vi khuẩn VTPG5 
Đánh giá khả năng phân hủy phenol của 
màng sinh học chủng vi khuẩn VTPG5 
Màng sinh học của chủng VTPG5 tạo ra 
trong điều kiện tối ưu có khả năng sinh trưởng, 
phát triển tốt nhất ở nồng độ 200 ppm phenol 
(hình 6). 
Tại nồng độ 200 ppm, chủng VTPG5 có khả 
năng phân hủy phenol với hiệu suất 99,8% sau 7 
ngày nuôi cấy. Hiện nay, trên thế giới đã có 
nhiều nghiên cứu về khả năng phân hủy phenol 
a b 
c d 
e 
Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học 
 106 
của vi khuẩn thuộc các chi khác nhau. Nor 
Suhaila et al. (2010) [ 9] đã công bố chủng 
Rhodococcus UKM-P được phân lập từ nước ô 
nhiễm dầu có hiệu suất phân hủy phenol đạt 
98,5% sau 7 ngày nuôi lắc với hàm lượng ban 
đầu là 0,4 ppm. Soudi & Kolahchi (2011) [ 11] 
đã công bố chủng R. erythropolis SKO-1 được 
phân lập từ đất nhiễm dầu ở Tehran, Iran có khả 
năng phân hủy phenol đạt 99,68% sau 3 ngày 
nuôi cấy. Liu et al. (2009) [ 5] đã công bố hai 
chủng Acinebacter sp.XA05 và Sphingomonas 
sp.FG03 được phân lập từ bùn hoạt tính và đất ô 
nhiễm phenol có hiệu suất phân hủy phenol lần 
lượt là 78% và 68% sau 60 giờ với hàm lượng 
ban đầu là 1 ppm. Nhóm tác giả Lin et al. 
(2008) [ 4] đã phân lập được chủng vi khuẩn 
Pseudomanas fluorescens được phân lập từ 
nguồn nước thải công nghiệp có khả năng sử 
dụng 85,4% phenol với hàm lượng ban đầu là 
3,2 ppm có bổ sung thêm 1% glucose sau 40 
ngày nuôi cấy. 
Hình 6. Khả năng sinh trưởng của chủng 
VTPG5 trong môi trường có bổ sung phenol ở 
các nồng độ khác nhau 
Ở Việt Nam, có rất ít các nghiên cứu về 
phân hủy phenol của vi sinh vật. Tại Viện Công 
nghệ sinh học, nhóm tác giả Cung Thị Ngọc 
Mai (2010) [ 6, 7] đã phân lập được hai chủng vi 
khuẩn BTL6 và BTL11 từ nước thải khu công 
nghiệp Từ Liêm, Hà Nội có khả năng phân hủy 
phenol lần lượt là 86,86% và 99,34% sau 7 ngày 
nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 7 ppm và 100 
ppm (có bổ sung thêm 0,5% glucose). Nhóm tác 
giả Le Thi Nhi Cong et al. (2012) [ 1] đã tuyển 
chọn được một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh 
học và có khả năng phân hủy tốt phenol từ các 
mẫu đất và nước nhiễm ở vùng biển Quảng 
Ninh. Sau 9 ngày thử nghiệm, hỗn hợp các 
chủng vi khuẩn này đã phân hủy được trên 98% 
phenol với hàm lượng ban đầu là 150 ppm. 
So sánh với các chủng vi khuẩn khác trên 
thế giới và ở Việt Nam, khả năng phân hủy 
phenol của chủng VTPG5 khá tốt. Các chủng 
khác có thời gian nuôi cấy khá lâu (40 ngày), 
trong khi chủng VTPG5 chúng tôi nuôi thử 
nghiệm sau 7 ngày trên lượng phenol ban đầu là 
200 mg/l. Những kết quả này đã phần nào cho 
thấy vai trò của từng chủng vi khuẩn có khả 
năng tạo màng tốt và khả năng phân hủy nước ô 
nhiễm phenol. Chủng vi khuẩn này sẽ được 
chúng tôi bổ sung tạo màng sinh học đa chủng 
để xử lý nước thải ô nhiễm phenol tại khu vực 
này hay các loại nước ô nhiễm có tính chất 
tương tự. 
KẾT LUẬN 
Chủng vi khuẩn Rhodococcus sp.VTPG5 
(LC057207) có khả năng tạo màng tốt nhất đã 
được tối ưu ở 37oC, pH 7, nồng độ muối NaCl 
là 1,5%, nguồn carbon là glucose, nguồn 
nitrogen là (NH4)2SO4 sau 4h giờ nuôi tĩnh. Tại 
điều kiện tối ưu, màng sinh học do chủng vi 
khuẩn này tạo thành có khả năng phân hủy 
99,8% phenol với hàm lượng ban đầu là 200 
ppm. 
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện với sự 
hỗ trợ kinh phí từ đề tài do Bộ Khoa học và 
Công nghệ cấp, mã số KC.04.21/11-15 và sử 
dụng trang thiết bị Phòng Thí nghiệm trọng 
điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Le Thi Nhi Cong, Ho Thanh Huyen, 
Nghiem Ngoc Minh 2012. Phenol 
degradation of a biofilm formed by a 
mixture of marine bacteria. VNU J. Sci., 
Natur. Sci. Technol., 28(2S): 75-81. 
2. Goto M., Kato M., Asaumi M., Shirai K., 
Venkateswaran K., 1994. TLC/FID method 
for evaluation of the crude-oil-degrading 
capability of marine microorganisms. J. 
Mar. Sci. Biotechnol., 2: 45-50. 
3. Lazarova V., Manem J., 2000. Innovative 
biofilm treatment technologies for waste 
Le Thi Nhi Cong et al. 
 107 
and wastewater treatment. In: Bryers JD 
(ed) Biofilm II: process analysis and 
application. Wiley-Liss, Inc: 159-206. 
4. Lin J., Reddy M., Moorthu V., Qoma B.E., 
2008. Bacterial removal of toxic phenol 
from an industrial effluent. Afr. J. 
Biotechnol., 7(13): 2232-2238. 
5. Liu Y. J., Kuschk P., Zhang A., Wang X. 
C., 2009. Characterization of phenol 
degradation by Acinetobacter sp. XA05 and 
Sphingomonas sp. FG03. Chem. Ecol., 
25(2): 107-117. 
6. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Hải Đăng, 
Nguyễn Văn Bắc, Nghiêm Ngọc Minh, 
2010. Nghiên cứu khả năng phân hủy 
hydrocarbon thơm đa nhân và phenol của 
chủng vi khuẩn BTL11 phân lập từ nước 
thải khu công nghiệp. Tạp chí Công nghệ 
Sinh học, 8(3B): 1739-1744. 
7. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Thị Khánh Vân, 
Nghiêm Ngọc Minh, 2010. Hình thái tế bào 
và khả năng phân hủy PAH và phenol của 
chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải khu 
công nghiệp. Tạp chí Khoa học và Công 
nghệ, 68(6): 101-106. 
8. Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., 
Takano K., Branda S., Kolter R., Kanaya 
S.2006. Biofilm formation by a Bacillus 
subtilis strain that produces gamma 
polyglutamate. Microbiology, 152: 2801-
2807. 
9. Nor Suhaila, Y., Ariff, A., Rosfarizan M., 
Abdul Latif I., Ahmad S.A., Norazah M. N., 
Shukor M. Y. A., 2010. Optimization of 
parameters for phenol degradation by 
Rhodococcus UKM-P in Shake. 
Proceedings of the World Congress on 
Engineering, 1: 601-604. 
10. Perron N., Welander U., 2004. Degradation 
of phenol and cresols at low temperatures 
using a suspended-carrier biofilm process. 
Chemosphere, 55(1): 45-50. 
11. Soudi M.R., Kolahchi N., 2011. 
Bioremediation potential of a phenol 
degrading bacterium, Rhodococcus 
erythropolis SKO-1. Progress in Biological 
Sciences, 1(1): 31-40. Winter/Spring. 
12. Swoboda-Collberg N. G., 1995. Chemical 
contamination of the environment: sources, 
types and fate of synthetic organic 
chemicals. In: Young, L.Y., Cerniglia, C.E. 
(Eds.), Microbial Transformation and 
Degradation of Toxic Organic Chemicals. 
Wiley, New York, USA: 27-74. 
13. Zhou J., Bruns M. A., Tiedje J. M., 1996. 
DNA Recovery from soils of diverse 
composition. Appl. Environ. Microbiol., 
62(2): 316-322. 
PHENOL DEGRADATION OF BIOFILM FORMED 
BY BACTERIAL STRAIN ISOLATED FROM OIL POLLUTED WATER 
SAMPLES COLLECTED IN VUNG TAU 
Le Thi Nhi Cong1, Trinh Thanh Trung2, Cung Thi Ngoc Mai1, Do Thi To Uyen1 
1Institute of Biotechnology, VAST 
2Institute of Microorganism and Biotechnology, Vietnam National University - Hanoi 
SUMMARY 
Phenol and phenolic compounds are found as major pollutants in various types of environmental sites. 
They exist in industrial wastewater of oil refineries, and petrochemical and phenol resin industry plants. To 
remove these components, using biofilm-forming microorganisms is new approach currently. From isolated 
bacteria which could degrade diesel oil and several hydrocarbon components containing in crude oil, we 
selected the strain VTPG5 having capacity of biofilm formation and phenol utilization. Comparing of the part 
of 16S rRNA of the strain with bacterial strains in NCBI and LNSP by using specific primer pair 9f and 
1525r, this strain belonged to the genus Rhodococcus then was named Rhodococcus sp.VTPG5. The gene was 
Khả năng phân hủy phenol của màng sinh học 
 108 
registed in Genbank NCBI with accession number LC057207. The optimal conditions to form biofilm of the 
strain after 48 hours were elucidated at 37oC, pH 7, 1.5% of NaCl with glucose and (NH4)2SO4 as carbon and 
nitrogen sources, respectively. These optimal biofilm-forming conditions were conducted to investigate 
phenol degradation capacity. As the result, the phenol degradation productivity of the biofilm formed by 
VTPG5 was 99.8% after 7 day-incubation with the initial concentration of 200 mg/l. The result gave a hint to 
apply the biofilm formed by VTPG5 to remove phenol and phenolic compounds from waste-water. 
Keywords: Rhodococcus, biofilm, biodegradation, oil polluted wastewater, phenol. 
Ngày nhận bài: 21-9-2015