Giáo trình Enzyme
Tên gọi của enzyme thường là tên gọi của cơ chất hay của kiểu phản
ứng mà nó xúc tác cộng với đuôi “ase”, ví dụ urease,, hydrolase v.v. Ngoài
ra còn có những tên gọi truyền thống theo thói quen, không cho thấy bản
chất hóa học của phản ứng do enzyme xúc tác, ví dụ pepsin, trypsin . cả hai
kiểu gọi tên nêu trên đều thiếu chính xác.
Để khắc phục tình trạng đó, Hội Hóa sinh học quốc tế đề nghị sử dụng
một hệ thống danh pháp và phân loại trên cơ sở bản chất của phản ứng được
xúc tác. Theo hệ thống này toàn bộ enzyme được gọi tên theo bản chất của
phản ứng được xúc tác và bản chất của các chất cho, chất nhận trong phản
ứng và được chia thành 6 nhóm lớn; mỗi nhóm lớn này lại được chia thành
nhiều phân nhóm; mỗi phân nhóm này lại được chia thành nhiều phân nhóm
nhỏ hơn, trong đó bao gồm những enzyme có cơ chất tác dụng giống nhau.
Mỗi nhóm, mỗi phân nhóm và mỗi enzyme được ký hiệu bằng một mã số
đặc trưng gồm tương ứng một, hai, ba hoặc bốn con số cách nhau bằng các
dấu chấm.
Tóm tắt nội dung tài liệu: Giáo trình Enzyme
![Giáo trình Enzyme Giáo trình Enzyme](https://s1.tailieubachkhoa.net/rl6k7x3q9zfh00j8/thumb/2021/12/02/giao-trinh-enzyme_vIbYNclQ10.jpg)
Enzyme - 3 - MỞ ĐẦU Enzyme là các chất xúc tác của các hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều kiện nhiệt độ và pH êm dịu. Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu giữ và biến đổi, các đại phân tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơn giản. Một số enzyme tham gia trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng một cách thích hợp. Thông qua hoạt động của các enzyme điều hòa các hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với nhau để tạo ra mối quan hệ hài hòa giữa các hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc duy trì sự sống. Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiển rất quan trọng. Đối với một số bệnh, đặc biệt là các rối loạn mang tính di truyền, có thể là do thiếu hay mất hẵn một hoặc một số enzyme trong các mô. Các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Xác định hoạt tính của một số enzyme xác định trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công cụ thực tế quan trọng không nhữ.ng trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thức ăn và trong nông nghiệp. Enzyme có vai trò thậm chí trong hoạt động hàng ngày của gia đình, ví dụ như trong việc lau chùi chỗ bẫn hoặc trong công việc chế biến thức ăn. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 4 - I. BẢN CHẤT PROTEIN CỦA ENZYME. Phần lớn lịch sử hoá sinh học là lịch sử nghiên cứu enzyme. Các chất xúc tác sinh học lần đầu tiên được phát hiện và mô tả vào những năm 1800 trong các nghiên cứu về tiêu hóa thịt bằng các chất tiết của dạ dày và sự biến đổi tinh bột thành đường bởi nước bọt và bởi các dịch chiết thực vật khác nhau. Trong những năm 1850 Louis Pasteur kết luận rằng quá trình lên men đường thành rượu bởi nấm men được xúc tác bởi “ferment”. Ông cho rằng những men này, mà về sau được gọi là enzyme, là những chất không tách rời khỏi cấu trúc của tế bào nấm men sống, một quan điểm tồn tại trong nhiều năm. Cho đến năm 1897 Eduard Buchner đã xác định rằng các dịch chiết nấm men có thể lên men đường thành rượu ngay cả khi chúng được tách khỏi cấu trúc của tế bào nấm men. Phát hiện này đã thúc đẩy các nhà sinh hóa tìm cách tách chiết nhiều enzyme khác nhau và nghiên cứu hoạt tính xúc tác của chúng. Công trình tách chiết và tinh chế urease của James Sumner năm 1926 đã thúc đẩy các nghiên cứu đầu tiên tính chất của các enzyme đặc hiệu. Sumner đã phát hiện được rằng các tinh thể urease được cấu tạo hoàn toàn từ protein và từ đó ông cho rằng tất cả enzyme là protein. Ý tưởng này qua các ví dụ khác đã tiếp tục được tranh cải thêm nhiều năm sau đó. Chỉ đến những năm cuối của thập kỷ 1930, sau khi John Northrop và các cộng tác viên của ông kết tinh được pepsin và trypsin và cũng xác định được chúng cũng là protein thì quan niệm của Sumner về enzyme mới được công nhận rộng rãi. Ngày nay hoá sinh học đã xác định được rằng tất cả enzyme là protein. Hoạt tính xúc tác của chúng phụ thuộc vào tính nguyên vẹn của cấu trúc nguyên thủy của protein. Nếu một enzyme bị biến tính hoặc bị phân ly thành các phần dưới đơn vị thì hoạt tính xúc tác của nó thường bị mất. Khi một enzyme bị phân giải thành aminoacid thì hoạt tính xúc tác của nó hoàn toàn không còn. Như vậy, cấu trúc bậc một, bậc hai, bậc ba và bậc bốn của protein enzyme là những yếu tố rất quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của chúng. Enzyme, cũng như các protein khác, có trọng lượng phân tử từ khoảng 12.000 đến hơn 1.000.000. Một số enzyme không cần các nhóm hóa học không phải aminoacid cho hoạt tính xúc tác của mình. Một số khác cần có các nhóm bổ sung gọi là cofactor (bảng 1) Những cofactor này có thể là một hoặc một số ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2+,hoặc Zn2+ hoặc một phân tử hữu cơ hay hữu cơ chứa lim loại phức tạp được gọi là coenzyme (bảng 2). Một số enzyme đòi hỏi cả coenzyme và một vài ion kim loại cho hoạt tính của mình. Một coenzyme hoặc ion kim loại liên kết cộng hóa trị với protein enzyme được gọi là nhóm thêm hay nhóm prosthetic. Một enzyme trọn vẹn GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 5 - có hoạt tính xúc tác cùng với coenzyme và (hoặc) ion kim loại hợp lại được gọi là holoenzyme. Phần protein của loại enzyme này được gọi là apoenzyme hay apoprotein. Coenzyme hoạt động như vật mang các nhóm chức đặc hiệu. Nhiều vitamin và các chất hữu cơ với hàm lượng nhỏ có trong thức ăn là các chất tiền thân của coenzyme. Bảng 1. Một số enzyme có chứa hoặc cần các nguyên tố vô cơ để làm cofactor. Cofactor Enzyme Fe2+ hoặc Fe3+ Cytochrome Oxydase Catalase, Peroxydase Cu2+ Cytochrome Oxydase Zn2+ Carbonic Anhydrase, Alcohol Dehydrogenase Mg2+ Hexokinase, Glucoso-6-phosphatase, Pyruvate Kinase Mn2+ Arginase, Ribonucleotide reductase K+ Pyruvate kinase Ni2+ Urease Mo Dinitrogenase Se Glutathione peroxidase Bảng 2. Một số coenzyme làm vật trung chuyển các nguyên tử hoặc các nhóm nguyên tử đặc hiệu.. COENZYME Nhóm được vận chuyển Chất tiền thân trong thức ăn của động vật có vú Thiamine pyrophosphate Aldehyde Thiamine (Vitamine B1) Flavine adenine dinucleotide Điện tử Riboflavine (Vitamine B2) Nicotinamide dinuclotide Điện tử Nicotinic acid (Niacin) Coenzyme A Nhóm acyl Acid pantothenic Pyridoxal phosphate Nhóm amine Pyridoxine (Vitamine B6) 5’- Deoxyadenosylcobalamine (Coenzyme B12) Các nguyên tử H và nhóm alkyl Vitamine B12 GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 6 - Biocytin CO2 Biotin Tetrahydrofolate Nhóm một carbon Folate Acid lipoic Điện tử và nhóm acyl Không cần có trong thức ăn II. DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI ENZYME Tên gọi của enzyme thường là tên gọi của cơ chất hay của kiểu phản ứng mà nó xúc tác cộng với đuôi “ase”, ví dụ urease,, hydrolase v.v... Ngoài ra còn có những tên gọi truyền thống theo thói quen, không cho thấy bản chất hóa học của phản ứng do enzyme xúc tác, ví dụ pepsin, trypsin ... cả hai kiểu gọi tên nêu trên đều thiếu chính xác. Để khắc phục tình trạng đó, Hội Hóa sinh học quốc tế đề nghị sử dụng một hệ thống danh pháp và phân loại trên cơ sở bản chất của phản ứng được xúc tác. Theo hệ thống này toàn bộ enzyme được gọi tên theo bản chất của phản ứng được xúc tác và bản chất của các chất cho, chất nhận trong phản ứng và được chia thành 6 nhóm lớn; mỗi nhóm lớn này lại được chia thành nhiều phân nhóm; mỗi phân nhóm này lại được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ hơn, trong đó bao gồm những enzyme có cơ chất tác dụng giống nhau. Mỗi nhóm, mỗi phân nhóm và mỗi enzyme được ký hiệu bằng một mã số đặc trưng gồm tương ứng một, hai, ba hoặc bốn con số cách nhau bằng các dấu chấm. Tên gọi của 6 nhóm enzyme và các phân nhóm quan trọng được giới thiệu trong bảng 3 cùng với bản chất của các phản ứng được xúc tác. Các phân nhóm nhỏ hơn thuộc mỗi phân nhóm trong bảng 3 được ký hiệu bằng những mã số gồm 2 hoặc 3 con số. Ví dụ phân nhóm thứ nhất của enzyme nhóm 1 (ký hiệu là phân nhóm 1.1) có ba phân nhóm nhỏ đầu tiên là 1.1.1, 1.1.2 và 1.1.3 đặc trưng cho các trường hợp mà chất nhận điện tử là NAD, NADP và cytochrome. Mã số của mỗi enzyme gồm 4 con số, ví dụ: 1.1.1.29 – Glycerophosphate dehydrogenase; 2.7.1.1 – Hexokinase 3.2.1.20 – α- Glucosidase; 4.1.1.1 – Pyruvate decarboxylase; 5.3.1.1 – Triosophosphate isomerase; 6.3.1.2 – Glutamin synthetase Bảng 3. Danh mục mã số của 6 nhóm enzyme và các phân nhóm chính của chúng Nhóm Phân nhóm Phản ứng được xúc tác GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 7 - 1. Oxydoreductase 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 Hydrogen hóa và dehydrogen hóa =CH–OH =C=O –CH=CH– –CH–NH2 =CH–NH– NADH, NADPH 2. Transferase 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 Vận chuyển các nhóm chức Các gốc 1 carbon Nhóm aldehyde hoặc cetone Acyl Liên kết glycoside Nhóm methylalkyl hoặc aryl Nhóm chứa nitơ Nhóm chứa phosphore Nhóm chứa lưu huỳnh 3. Hydrolase 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Các phản ứng thủy phân Ester Glycoside Eter Peptide Các liên kết C-N khác Các anhydrit acid 4. Liase 4.1 4.2 4.3 Tạo liên kết đôi =C=C= =C=O =C=N– 5. Isomerase 5.1 5.2 5.3 5.4 Đồng phân hóa Rasemase và epimerase Xis-trans-isomerase Oxy hóa nội phân tử Transferase nội phân tử 6. Ligase 6.1 6.2 6.3 6.4 Tạo ra liên kết nhờ ATP –C=O ≡C–S– =C=N– ≡C–C≡ Khi tên hệ thống của enzyme quá dài hoặc sử dụng không thuận tiện, người ta có thể dùng tên gọi thông dụng của chúng, ví dụ tên hệ thống của enzyme xúc tác phản ứng ATP + D-Glucose ⎯⎯⎯→ ADP + D-Glucoso-6-phosphate là ATP:glucose phosphotransferase; tên gọi này cho thấy enzyme xúc tác sự vận chuyển nhóm phosphate từ ATP đến glucose. Mã số của enzyme là 2.7.1.1: số 2 cho biết enzyme thuộc nhóm thứ 2; con số 7 cho biết enzyme thuộc phân nhóm phosphotransferase; số 1 tiếp theo cho biết chất nhận GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 8 - nhóm phosphate là nhó –OH; Số 1 cuối cùng cho biết chất nhận nhóm phosphate là D-glucose. Khi tên hệ thống của enzyme quá dài có thể dùng tên thông dụng của nó, trong trường hợp này có thể gọi tên enzyme là hesokinase III. ĐỘNG HỌC CỦA CÁC PHẢN ỨNG ENZYME. Bất kỳ phản ứng hóa học nào, ví dụ phản ứng A ⎯→ P, sở dĩ xảy ra được là nhờ một phần năng lượng trong số các phân tử A chứa năng lượng lớn hơn số phân tử còn lại, làm cho chúng tồn tại ở trạng thái hoạt động. Ở trạng thái này dễ dàng phá vỡ một liên kết hóa học hoặc tạo ra một liên kết mới để làm xuất hiện sản phẩm P. Năng lượng cần để chuyển toàn bộ số phân tử của một mol vật chất ở điều kiện nhất định sang trạng thái kích động được gọi là năng lượng hoạt hóa. Năng lượng này cần thiết để chuyển các phân tử tham gia phản ứng sang một trạng thái trung gian giàu năng lượng tương ứng với đỉnh của hàng rào hoạt hóa (hình 1). Tốc độ của phản ứng tỉ lệ với nồng độ của phân tử ở trạng thái trung gian này. Năng lượng hoạt hóa được đo bằng năng lượng cần thiết để chuyển các phân tử lên trạng thái hoạt động. Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa vốn cần để phản ứng có thể xảy ra tự phát. Bảng 4 cho biết năng lượng hoạt hóa đối với một số phản ứng. Phản ứng phân hủy peroxide hydro đòi hỏi 18.000 KCal/mol nhưng sẽ giảm xuống còn 11.700 khi có platin xúc tác và còn giảm thấp hơn nữa khi chất xúc tác là enzyme catalase. Rõ ràng, catalase có hiệu quả hơn nhiều so với chất xúc tác vô cơ đối với phản ứng này. Trên thực tế catalase có hiệu qủa đến mức chỉ cần một giá trị năng lượng hoạt hóa rất nhỏ cho phản ứng. Vì vậy mà phân giải H2O2 bằng catalase xảy ra hầu như ngay tức khắc với tốc độ nhanh nhất trong số các phản ứng enzyme đã biết. Bảng 4. còn cho thấy các enzyme khác cũng giảm năng lượng hoạt hóa xuống mức thấp hơn đáng kể so với các chất xúc tác vô cơ. Vì lý do đó mà các phản ứng enzyme có thể xảy ra với tốc độ cao ở điều kiện nhiệt độ sinh lý. Bảng 4 . Năng lượng hoạt hóa đối với các phản ứng xúc tác bằng enzyme và bằng các chất xúc tác khác. Phản ứng Chất xúc tác Ea (Kcal/mol) Phân giải peroxide hydro không platin catalase 18.000 11.700 < 2.000 Thủy phân ethyl butyrate ion hydro ion hydroxyl lipase tuyến tụy 16.800 10.200 4.500 GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 9 - Thủy phân casein ion hydro trypsin 20.600 12.000 Thủy phân saccharose ion hydro invertase nấm men 25.000 8.000 -10.000 Thủy phân β-methylglucoside ion hydro β- glucosidase 32.600 12.200 Khi tăng nhiệt độ năng lượng chuyển động nhiệt của phân tử tăng lên, làm cho số phân tử có khả năng đạt trạng thái trung gian tăng lên. Vì thế khi tăng nhiệt độ lên 10o, tốc độ của phu hóa học tăng lên khoảng hai lần (Q10 = 2). Khác với tác dụng của nhiệt độ, chất xúc tác làm tăng tốc độ của phản ứng bằng cách làm giảm năng lượng hoạt hóa. Hình 1. Biến thiên năng lượng tự do trong các phản ứng hóa học. Sự kết hợp giữa chất phản ứng và chất xúc tác làm xuất hiện trạng thái trung gian mới với mức năng lượng hoạt hóa thấp hơn. Khi sản phẩm hình thành, chất xúc tác lại được giải phóng ở trạng thái tự do. Các phản ứng enzyme cũng tuân theo những nguyên tắc chung của động học các phản ứng hóa học. Tuy nhiên, chúng còn có những đặc điểm riêng. Một trong những đặc điểm đó là hiện tượng bão hòa cơ chất. Ở nồng độ cơ chất thấp tốc độ của phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chậm dần, và khi nồng độ cơ chất đạt một giá trị nào đó, tốc độ của phản ứng không tăng nữa. Trong những điều kiện đó nồng độ enzyme là yếu tố quyết định tốc độ phản ứng. Mặc dù hiện tượng bão hòa cơ chất đặc trưng cho mọi enzyme, nhưng giá trị cụ thể của nồng độ cơ chất ... e, nhóm β-SH của cysteine, vòng phenol của tyrosine, nhân imidasol của histidine, các nhóm OH của serine, threonine, nhóm guanidine của arginine và imidasol của tryptophan. Quá trình kết hợp enzyme sẽ xảy ra một cách trực tiếp khi chất mang có chứa các nhóm chức có khả năng liên kết trực tiếp nói trên trong phân tử protein enzyme. Ví dụ gốc anhydride maleic liên kết với nhóm ε-NH2 của lysine. Trong các trường hợp khác sự liên kết giữa chất mang và protein enzyme chỉ xảy ra sau khi chất mang đã được hoạt hóa . Việc hoạt hóa sơ bộ chất mang có thể được thực hiện bằng nhiều cách. Ví dụ, các nhóm hydroxyl của dextran hoặc các polyoside khác có thể được hoạt hóa bằng bromur cyan (BrCN). Sau đó chất mang đã được hoạt hóa mới liên kết với enzyme (hình 19). GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 71 - Các chất mang có chứa nhóm amin như aminobenzoylcellulose, polyaminostyrol có thể được hoạt hóa bằng phản ứng diazo. Hình 19. Gắn enzyme với vật mang đã được hoạt hóa bằng bromur cyan (BrCN). Ví dụ, polyaminostyrol trước hết được diazo hóa bằng natri nitrit trong môi trường acid thành muối diazo, sau đó mới kết hợp với enzyme: NaNO /HCl 2 R – NH2 R – N2+X R: Gốc alkyl, aryl Muối diazo của chất mang X: Gốc acid OH R – N2+X + Enzyme OH RN=N Enzyme Enzyme liên kết với chất mang Enzyme liên kết với chất mang chưa được hoạt hóa đãđược hoạt hóa Phản ứng kết hợp enzyme được tiến hành nhanh chóng trong điều kiện nhiệt độ thường và dung dịch nước trung tính. Nếu chất mang có chứa nhóm amin có thể hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với phosgen hoặc tiophosgen để tạo thành dẫn xuất isosianat hoặc izothyosianat. Các nhóm isosianat hoặc izothyosianat ở pH trung tính sẽ liên kết dễ dàng với nhóm ε-NH2 của lysine. Cl O = C R – N = C = O + HCL R – NH2 + Cl Cl S = C R – N = C = S + HCl Cl R – N = C = O + H2N - E R – NH – CO – NH - E Bằng phương pháp này người ta đã điều chế được các dẫn xuất enzyme cố định như trypsin, chimotrypsin, α-, β-amylase, glucoamylase. Nếu chất mang có chứa nhóm –COOH như CM-cellulose hoặc nhựa tổng hợp thì cần được hoạt hóa trước khi gắn kết với enzyme bằng các phương pháp azit, carbodiimit. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 72 - - Hoạt hóa bằng phương pháp azit: O H2N – NH2 O - O – CH2 – C – O – CH3 O – CH2 – C –NH– NH2 CM-cellulose Hydrazin Hydrazit NaNO2 O E – NH2 O - O – CH2 – C – N = N+- NH - O – CH2 – C – NH – E Azit Enzyme cố định Các enzyme như trypsin, DNA-ase, chimotrypsin, bromelin đã được cố định bằng phương pháp này. - Hoạt hóa bằng phương pháp carbodiimit: - O – CH2 – COOH + N = C = N - + H2N – E -OH CM-Cellucose N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide Enzyme - O – CH2 – CO-NH – E + NH - C O NH - OH Dixyclohexylure Vì phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH=5) nên phương pháp này đặc biệt thuận lợi đối với các enzyme có tính acid như pepsin. • Kết hợp đồng hóa trị giữa các phân tử enzyme với chất mang. Cố định enzyme bằng cách liên kết đồng hóa trị được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: 1/ Liên kết đồng hóa trị được tạo ra giữa các nhóm phản ứng của vật mang và enzyme; trong một số trường hợp vật mang cần được hoạt hóa sơ bộ; 2/ Các phân tử enzyme sau khi được hấp phụ trên chất mang hoặc nằm trong lòng phân tử chất mang liên kết với nhau nhờ tính lưỡng chức hoặc tính đa chức của chất phản ứng. Người ta thường dùng aldehyde glutaric để gắn các nhóm amin của lysine ở các phân tử enzyme. Ví dụ, trypsin cố định trypsin được điều chế bằnh cách dùng aldehyde glutaric 2% để liên kết các phân tử enzyme và gắn chúng vào aminoethylcellulose. b/ Phương pháp “gói” enzyme trong khuôn gel. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 73 - Để gói enzyme vào khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa học các gel khi có mặt đồng thời enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp enzyme bị giữ chắc trong gel. Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách ép qua rây có lỗ nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ thấp. Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1933) thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N,N’-methylenbisacrylamide. Phương pháp này thường dùng do chất trùng hợp thu được dễ tạo thành dạng hạt và tùy thuộc điều kiện tiến hành mà gel có thể có độ xốp khác nhau. Sau đây là một số phương pháp “gói” enzyme. • Các gel có thể được hình thành từ các polymer tổng hợp như acrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate, tạo phức càng cua bằng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan. Enzyme được hòa tan hoặc phân tán trong một dung dịch monomer và sau đó trùng hợp trong sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo phức càng cua. Gel có thể cắt thành màng đặt trên một giá thể rắn, hoặc cũng có thể nghiền thành bột sau khi loại trừ nước. Alginate và caraghenan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel rất tốt và rất thuận lợi để bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn. • Các enzyme cũng có thể bị “nhôùt” trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp. Với cách này người ta cho dịch lỏng chảy bên trong sợi, do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp với các màng. Một nhũ tương của cellulose triacetate trong methylene chlorua và enzyme trong dung dịch đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất nitơ. Các sợi đi ra khỏi khuôn được nhúng vào một cái bể đông tụ có chứa toluel, sau đó được làm khô trong chân không. Các sợi này bền với acid yếu hoặc kiềm yếu, lực ion cao và chịu được một số dung môi hữu cơ. Tuy nhiên phương pháp này chỉ thích hợp đối với những enzyme khó bị mất hoạt tính trong các dung môikhông hòa lẫn với nước. • Phương pháp gói enzyme trong các bao vi thể (microcapsul). Enzyme được gói trong các bao vi thể có màng bán thấm được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán của enzyme ra ngoài và đủ lớn để cơ chất đi vào và sản phẩm phản ứng đi ra dễ dàng. Có nhiều phương pháp gói enzyme trong microcapsul. Sau đây là một trong các phương pháp đó. Cho một dung dịch loãng chứa enzyme và một GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 74 - monomer ưa nước trong một dung môi hữu cơ không hòa lẫn trong nước để tạo nhũ tương, sau đó thêm một monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo ra một màng bao quanh những giọt lỏng nhỏ. Thường phải thêm vào một tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương cũng như để điều chỉnh các capsul có kích thước mong muốn từ 1 đến 100 µm. • Phương pháp tiền polymer để gói các chất xúc tác sinh học. Cố định enzyme bằng phương pháp này có những ưu điểm như sau: - Quá trình gói rất đơn giản trong những điều kiện nhẹ nhàng; - Các chất tiền trùng hợp không chứa các monomer vốn có thể gây ảnh hưởng xấu đến enzyme đã được gói; - Cấu trúc lưới của gel có thể được điều chỉnh bằng cách dùng các tiền polymer có chiều dài chuỗi bất kỳ; - Các tính chất hóa lý của gel (như sự cân bằng giữa tính háo nườc và tính kỵ nước, bản chất ion) có thể định hướng trước bằng cách chọn các tiền polymer thích hợp vốn đã được tổng hợp hóa học trong điều kiện vắng mặt enzyme. Dưới đây là một ví dụ về phương pháp tiền polymer. Đó là phương pháp tạo liên kết chéo giữa các tiền polymer bằng cách chiếu tia cực tím để gói enzyme. Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa chất tiền polymer và enzyme thì sẽ tạo ra các liên kết chéo giữa các gốc của tiền polymer và một gel được hình thành bao lấy enzyme. Sư gói enzyme bằng phương pháp này có thể tiến hành ở điều kiện nhẹ nhàng, tránh được các thay đổi pH quá kiềm hoặc quá acid, thời gian lại rất nhanh, chỉ trong vòng từ 3-5 phút. Với phương pháp này có thể gói enzyme, tế bào vi sinh vật hoặc các bào quan. c/ Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ trên các chất mang có hoặc không có điện tích. Với phương pháp này enzyme được hấp phụ trên các chất có hoạt tính bề mặt như than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin, polyacrylamide, nilon, polystyrol v.v...và một số nhựa trao đổi ion, silicagen, thủy tinh. Trong trường hợp chất mang không có lỗ enzyme được đính vào chất mang thành từng lớp trên bề mặt; khi chất mang có lỗ thì các phân tử enzyme sẽ xâm nhập vào trong các lỗ. 3. Một số đặc tính của enzyme cố định. Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất của enzyme như độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học. Thông thường việc cố định làm tăng GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 75 - đáng kể độ bền của enzyme. Ví dụ, cố định protease làm tăng độ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần. Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của enzyme tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích của enzyme cũng được mở rộng. Nhiệt độ cao làm cho enzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba của enzyme bị phá vỡ và enzyme bị mất hoạt tính. Khi enzyme được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biến tính sẽ bị ngăn cản, làm cho enzyme chịu được nhiệt độ cao. Trong trương hợp đối với các enzyme thủy phân protein, ví dụ papain và trypsin sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tương tự phân. Điều này rất có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của enzyme. Sự biến đổi đặc điểm động học của enzyme do việc cố định gây ra có thể được minh họa qua ví dụ đối với enzyme glutamate dehydrogenase: đối với enzyme cố định trên màng collagen hằng số Michaelis dành cho acid glutamic tăng 6 lần, tác dụng hoạt hóa của ADP cũng tăng lên đáng kể. Một trong các nguyên nhân làm biến đổi tính chất của enzyme khi chúng được cố định là sự thay đổi của phản ứng môi trường. Enzyme thường được cố định trên các chất mang có điện tích. Ví dụ một chất trao đổi anion mang điện tích âm được bao quanh bởi một môi trường giàu proton, và vì thế pH trong các lớp nằm kế sát với enzyme được cố định sẽ thấp hơn so với pH của môi trường dung dịch. Điều đó làm cho đường cong phụ thuộc pH của hoạt tính enzyme cố định trên các chất mang anionit, cationit và trung tính sẽ khác nhau. 4. Ứng dụng của enzyme cố định. a/ Trong công nghiệp. - Từ năm 1969 Wilson đã xây dựng thành công một xưỡng thực nghiệm để sản xuất liên tục glucose bằng glucoamylase cố định; - Từ 1971 người ta đã thành công trong việc dùng chimotrypsin cố định trên carboxymethylcellulose để làm động tụ sữa thay cho renin đắt tiền; - Enzyme rasemase cố định đã được sử dụng để chuyển toàn bộ D- aminoacid thành L- aminoacid tương tứng, làm tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm lên gấp đôi. - Làm trong nước trái cây bằng cách xử lý enzyme phân giải pectin hay thủy phân protein trong bia bằng protease hoàn toàn có thể được thực hiện trong các cột chứa các enzyme cố định tương ứng. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 76 - - Cố định enzyme glucoisomerase trong cột hoàn toàn có hiệu quả đối với việc ngăn ngừa sự chuyển hóa glucose thành fructose, làm cho độ ngọt của nước giải khát bị giảm. Nhờ cố định enzyme glucoisomerase việc thu nhận xirô gluco-fructose ngày nay đã trở thành một quy trình công nghiệp quan trọng và phổ biến. Độ chịu nhiệt cao của enzyme này cho phép thực hiện quá trình sản xuất ở nhiệt độ 60-70o, làm giảm đáng kể khả năng nhiễm khuẩn của thiết bị enzyme. b/ Trong y học. - Urease gắn trong vi tiểu cầu đã được sử dụng có hiệu quả để loại trừ urea của máu trong thận nhân tạo; - Vi tiểu cầu chứa catalase đã có thể thay thế một cách có hiệu quả số catalase bị thiếu trong cơ. - Đưa vi tiểu cầu có gắn enzyme L-asparaginase vào cơ thể có khả năng ức chế sự phát triển của một số u ác tính vì sự phát triển của những u này phụ thuộc vào sự có mặt của L-asparagin. c/ Trong phân tích hóa sinh. Glucoamylase gắn đồng hóa trị với polystyrol được dùng để xác định tự động glucose; Điện cực urease cố định dùng để xác định tự động urea trên dòng liên tục; Điện cực alcoholoxydoreductase cố định được dùng để xác định methanol, ethanol trong dung dịch nước. Cố định enzyme tạo ra khả năng nghiên cứu hàng loạt các vấn đề lý thuyết của enzyme học. Vi dụ cố định enzyme có thể được sử dụng để ngăn cản sự phối hợp ngẫu nhiên của các phần dưới đơn vị của các enzyme oligomer. Sử dụng việc cố định có thể giải quyết vấn đề liệu một enzyme ở dạng các phần dưới đơn vị có hoạt tính hay không. Nếu các phần dưới đơn vị ở trạng thái cố định có hoạt tính thì qua so sánh hoạt tính của enzyme với hoạt tính của các oligomer cố định sẽ thu được những thông tin có gía trị về vai trò của sự tương tác giữa các phần dưới đơn vị trong việc thực hiện chức năng của enzyme. Ngày nay ta biết rõ rằng phần lớn enzyme nội bào hoạt động trong môi trường tương tự như gel hoặc chúng được “gói” trong màng ti thể, lục lạp hoặc các cơ quan tử khác. Vì vậy, các enzyme cố định có thể là mô hình tốt để nghiên cứu hoạt động của enzyme. Kỹ thuật cố định không chỉ dùng cho các chế phẩm enzyme mà có thể dùng cho các tế bào vi sinh vật nguyên vẹn. Để cố định các tế bào vi sinh vật GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 77 - người ta thường dùng gel polyacrylamide, cellulose, caraganine và các vật liệu khác. Đáng lưu ý là trong nhiều trường hợp hoạt tính enzyme của các tế bào cố định cao hơn nhiều so với các enzyme tự do. Các tế bào cố định thậm chí có thể thực hiện được các quá trình sinh hóa tinh vi và phức tạp. Ví dụ các tế bào Rhisobium lupini của nốt sần cây lupin vàng giữ được rất lâu hoạt tính cố định đạm của chúng. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
File đính kèm:
giao_trinh_enzyme.pdf