Báo cáo Thí nghiệm vi sinh môi trường

BỘ CÔNG THƯƠNG 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG 
----- 
Báo cáo: THÍ NGHIỆM 
VI SINH MÔI TRƯỜNG 
 SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516 
 Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470 
 Trần Thiên Ân:3009110373 
 Nguyễn Dũ:3009110440 
TP.HCM,tháng 6 năm 2013 
 MỤC LỤC 
PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ............................................................................................................ 1 
1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: ......................................................................................... 1 
1.1. Dụng cụ ......................................................................................................................................... 1 
1.2. Thiết bị ...................................................................................................................................... 5 
PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH ............................................ 10 
2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời ............................................................................................................. 10 
2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường ............................................................................................................... 11 
2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : ................................................................................................. 12 
2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. ................................................................................................... 13 
2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. ....................................................................................................... 15 
2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu. ......................................................................................................... 18 
2.2.7 Phương pháp hộp đổ ............................................................................................................... 19 
2.2.8 Phương pháp hộp trải .............................................................................................................. 20 
2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn ........................................................................................................ 22 
2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) ............................................................................... 23 
2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi ................................................................................................ 26 
PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG ................................................................... 28 
3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose ......................................................................................................... 28 
3.1.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 28 
3.1.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 28 
3.1.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 31 
3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor ........................................................................................................ 31 
3.2.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 31 
3.2.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 31 
3.2.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 32 
3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá ............................................................ 32 
3.3.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 32 
3.3.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 33 
3.3.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 35 
3.4. E.coli,Coliform ................................................................................................................................ 36 
 3.4.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 36 
3.4.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 36 
3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: .................................................................................................... 38 
3.5.1. Nguyên tắc .................................................................................................................................... 38 
3.5.2. Kết quả .......................................................................................................................................... 40 
3.5.3. Nhận xét .................................................................................................................................... 41 
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 42 
4.1. Kết luận ............................................................................................................................................ 42 
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................................................... 42 
4.3. Bài học kinh nghiệm ........................................................................................................................ 43 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 1 
PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 
1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 
1.1. Dụng cụ 
Dụng cụ Hình ảnh Công dụng 
Đĩa petri 
Chứa môi trường nuôi 
cấy VSV. 
Ống nghiệm 
 Dùng để chứa đựng 
dung dịch với thể 
tích nhỏ, nuôi cấy vi 
sinh vật trong môi 
trường lỏng hay môi 
trường thạch. 
Bình tam giác. 
Chứa môi trường nuôi 
cấy hay dung môi hóa 
chất trong pha chế môi 
trường. 
Phiến kính và lá 
kính. 
Phiến kính:chứa giọt 
VSV ở trạng thái sống 
hoặc nhuộm màu khi 
quan sát bằng kính 
hiển vi. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 2 
Lá kính : dung để đậy 
lên giọt VSV trên 
phiến kính để quan sát 
trạng thái sống của tế 
bào VSV. 
Cốc thủy tinh 
Dùng để chứa cồn, hóa 
chất 
Que trang 
Trải giọt sinh khối 
VSV lên bề mặt thạch. 
Que cấy vòng Ria trên bề mặt thạch 
hay phân lập VSV 
trên bề mặt thạch 
hoăc cấy chuyền trên 
môi trường lỏng 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 3 
Đèn cồn Tạo không gian vô 
trùng, khử trùng các 
loại que cấy. 
Micropipette 
Định lượng một thể 
tích chính xác VSV, 
môi trường nuôi cấy 
hay dung dịch hóa 
chất. 
Kính lúp Quan sát các vật có 
kích thước nhỏ. 
Phễu thủy tinh. 
 Chuyển dung môi từ 
dụng cụ chứa này 
sang dụng cụ chứa 
kia dùng khi miệng 
dụng cụ chứa nhỏ. 
Ống đong. 
Sử dụng để định mức 
lượng hóa chất cần 
dùng với độ chính xác 
cao. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4 
Cối. 
Nghiền nhỏ mẫu đất. 
Bình tam giác có nút 
mài. 
Dùng để chứa cồn 
hoặc các loại hóa chất 
dễ bay hơi trong 
không khí. 
Chậu thủy tinh 
Chứa rác như giấy 
báo,gang tay, khẩu 
trang  đã sử dụng. 
Giá để ống nghiệm 
Để ống nghiệm tránh 
vỡ, lăn ra ngoài 
Kẹp sắt 
Dùng để giữ vật mà 
yêu cầu không sử 
dụng tay để giữ, vd : 
giữ phiến kính hơ trên 
ngọn lửa cồn, tn phân 
giải xenlulozo 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 5 
Giá để pipet 
Dùng để để pipet, đũa 
thủy tinh. 
Bình tia 
Chứa nước cất. 
Bóp cao su 
Sử dụng hơi để hút 
hóa chất thông qua 
pipet. 
1.2. Thiết bị 
Thiết bị Cách vận hành Hình ảnh 
Nồi hấp 
khử trùng 
- Mở nắp nồi hấp, lấy 
hai giỏ inox ra ngoài. 
- Cho nước cất vào nồi 
hấp đến khi ngập con ốc cảm 
ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục 
cho giỏ inox lớn vào nồi 
hấp. 
- Cho dụng cụ và môi 
trường cần hấp khử trùng 
vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi 
hấp. 
- Đóng nắp và khóa van. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 6 
- Bật công tắt ở bên 
hông, cài đặt thông số nhiệt 
độ,áp suất, thời gian, bấm 
lần lượt các nút “set” và 
“start”. 
- Khi đã có tín hiệu thì 
mở nồi hấp ra, chờ 1 phút 
cho bớt nóng và lấy dụng cụ 
môi trường ra (nếu muốn hạ 
áp suất của nồi hấp thì mở 
nắp nồi hấp ) . 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 7 
Tủ sấy 
- Mở cửa tủ sấy cho vật 
liệu sấy vào và đóng lại ( đẩy 
thanh tay cầm sang trái để 
mở, sang trái để đóng). 
- Cắm nguồn điện chờ 
10s rồi mới bật on/off để mở 
máy. 
- Nhấn phím “▲▼” để 
chọn chương trình P3, chờ 5s 
để xác nhận chương trình đã 
chọn . 
- Nhấn phím X/W để cài 
nhiệt độ sấy( dùng phím 
“▲▼” để cài nhiệt độ ). 
- Nhấn phím X/W để cài 
thời gian sấy ( dùng phím 
“▲▼” để cài thời gian), nếu 
chạy liên tục thì để thời gian 
cài đặt bằng 0. 
- Chờ 5s máy tự động 
lưu thong số vừa cài ở bước 4 
và 5. 
- Khi đạt nhiệt độ sấy 
màn hình nhấp nháy liên tục 
hai thông số đã cài đặt, khi 
thời gian cài đựt về 0 thì kết 
thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy 
lấy vật liệu sấy ra. 
- Vệ sinh tủ sấy 
Cân điện tử 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 8 
Máy lắc 
ống nghiệm 
- Cắm điện. 
- Đặt ống nghiệm lên phần 
núm đen . 
+ Bật công tắc lên nếu 
muốn sử dụng chế độ lắc 
gián đoạn(Manual). Nhấn 
nhẹ và giữ chặt ống nghiệm 
trong vài giây rồi nhấc ống 
nghiệm ra. 
+ Bật công tắc xuống nếu 
muốn sử dụng chế độ lắc liên 
tục(Continuous) 
Lò vi ba 
Bếp điện 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 9 
Máy dập 
mẫu 
Kính hiển 
vi quang 
học 
- Đặt tiêu bản 
lên bàn mẫu, dùng 
kẹp để cố định tiêu 
bản. 
- Chọn vật kính: 
tùy theo mẫu tiêu bản 
và mục đích quan sát 
mà ta chọn vật kính 
thích hợp. 
- Nhỏ 1 giọt dầu soi lên 
phiến kính khi soi vật kính 
x100. 
- Điều chỉnh ánh sáng 
- Điều chỉnh tụ quang 
- Điều chỉnh cỡ màn 
chắn tương ứng với vật kính. 
- Mắt nhìn thị 
kính, tay vặn ốc chỉnh 
thô đến khi thấy hình 
ảnh mờ, tiếp tục điều 
chỉnh ốc chỉnh tinh 
đến khi nhìn rõ vật 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 10 
PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN 
TÍCH VI SINH 
2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời 
Nội dung công 
việc 
Hình ảnh minh họa Ghi chú 
Bước 1: Rửa sạch 
lam và lamen 
o Cho lam và 
lamen vào chậu 
thủy tinh 
o Đổ dd HCl 
10% vào và ngâm 
trong ... phút 
o Rửa lại 
bằng nước 
Sử dụng gang tay, khẩu 
trang trong quá trình 
thao tác. 
Bước 2: cho một 
giọt sinh khối 
VSV lên phiến 
kính. 
 Nếu là nấm mốc thì ta 
phải cố định bằng một 
giọt nước. 
Bước 3: Đặt lá 
kính lên phiến 
kính. 
o Đặt lá kính 
song song với 
phiến kính cách 
phiến kính 
khoảng 2 cm 
o Đặt lá kính 
từ từ xuống 
phiến kính, dung 
khăn giấy khô 
thấm nước tràn 
ra bên ngoài. 
 Có thể đặt lá kính lên 
phiến kính bằng cách: 
đậy lá kính sao cho chân 
của lá kính chạm vào 
giọt nước hay giọt màu, 
nghiêng một góc 450 
và hạ lá kính xuống để 
có bọt khí 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 11 
2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường 
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú 
Bước 1: Cân từng thành 
phần của môi trường 
 Cân chính xác 
lượng hóa chất 
 Tắt hết thiết bị quạt 
Bước 2: hòa tan từng 
thành phần của môi 
trường trong một lượng 
nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn 
tất cả các thành phần dinh 
dưỡng với nhau và thêm 
nước cho đủ thể tích 
 Đối với môi trường 
đặt như agar phải 
nấu tan chảy xong 
mới hòa tan các 
thành phần khác 
Bước 3: Phân phối môi 
trường vào các dụng cụ 
chứa, đóng nút bông, bao 
gói giấy báo 
Bước 4: Đặt tiêu 
bản lên bàn mẫu, 
điều chỉnh kính 
hiển vi để quan 
sát. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12 
Bước 4: Hấp tiệt trùng 
trong nồi hấp và làm 
nguội tới nhiệt độ thích 
hợp và gieo cấy vsv 
 Hấp tiệt trùng ở 
121
0
C, trong 15 
phút 
2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : 
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú 
Bước 1: Rửa sạch dụng 
cụ và hấp khử trùng 
 Bao gói dụng cụ trước 
khi hấp 
Bước 2:Cho vào mỗi 
ống nghiệm 7-8 ml 
môi trường 
 o Sử dụng gang 
tay ,khẩu trang trong 
quá trình thao tác. 
o Khử trùng tay 
và khu vực làm thí 
nghiệm bằng cồn 
trước khi tiến hành. 
o Thao tác nhanh, 
môi trường rất dễ 
đông . 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 13 
Bước 3: Làm nút bông 
và bịt nắp ống nghiệm 
Bước 4: 
 Để các ống nghiệm 
nghiêng <25
0
, phần 
thạch nghiêng khoảng 
1/2-1/3 ống nghiệm. 
 Chờ môi trường 
đông lại, bảo quản ở 
nhiệt độ thích hợp. 
 Chú ý phần thạch 
cách miệng ống 
nghiệm 2 cm. 
 Không di chuyển 
ống nghiệm khi môi 
trường chưa đông đặc. 
2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. 
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú 
 Bước 1: Chuẩn bị 1 
ống nghiệm thạch 
nghiêng có môi trường 
phù hợp và 1 ống mẫu 
chứa VSV. 
 Chuẩn bị mẫu VSV 
phải đúng và phát 
triển tốt. 
o Sử dụng khẩu trang trong suốt quá trình cấy. 
o Khử trùng sạch tay và bàn làm việc. 
Bước 3: 
o Tay trái cầm 2 
ống nghiệm (ống chứa 
 Đốt que cấy trên 
ngọn lửa đèn cồn đến 
khi đỏ 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 14 
mẫu và ống cấy) 
o Tay phải cầm 
que cấy,ngón út và 
lòng bàn tay của tay 
phải cầm và giữ nút 
bông 
 Không để ống 
nghiệm ở quá xa đèn 
cồn 
Bước 4: 
o Đưa que cấy đã 
khử trùng vào bên 
trong ống nghiệm 
chứa vsv 
o Lấy một ít sinh 
khối vsv và đậy nút 
bông lại 
 Để vào thành ống 
nghiệm cho bớt nóng 
 Không để đầu que 
cấy chạm vào miệng 
và thành ống nghiệm 
Bước 5: 
o Mở nút bông ở 
ống thạch cần cấy, khử 
trùng miệng ống 
nghiệm 
o Rồi đưa que cấy 
vào đáy ống nghiệm 
ria theo đường dzích 
dzăc từ dưới kéo về 
hướng miệng ống 
nghiệm 
 Tránh để vỡ thạch. 
 Không ria nhiều 
lần. 
Bước 6: 
o Rút que 
cấy ra, hơ miệng 
ống nghiệm 
o Đóng nút 
bông lại 
o Khử trùng 
que cấy và để 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 15 
vào giá 
Bước 7 : Dán nhãn, bao 
gói, bảo quản. 
2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. 
2.2.5.1. Kỹ thuật hộp ria. 
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú 
Bước 1: Chuẩn bị 
o Petri chứa 
môi trường thạch 
o Ống 
nghiệm chứa vsv 
cần cấy,nút bông 
bằng gạc 
o Dụng cụ 
cần thiết (que 
cấy, cồn, đèn 
cồn, bông,) 
 Petri không bị nhiễm 
sv khác 
Bước 2: Dùng bông 
gòn thấm nước thấm 
cồn sát trùng tay và 
mặt bàn chuẩn bị cấy. 
Nhóm ... hỉnh 
thô, điều chỉnh cho 
vật mẫu lên sát vật 
kính cho đến khi 
thấy được ảnh vsv 
o Dùng ốc chỉnh 
tinh vặn chỉnh để 
thấy rõ ảnh vsv 
o Để quan sát 
ảnh có độ phóng đại 
lớn hơn, chuyển 
sang vật kính lớn 
hơn và điều chỉnh ốc 
chỉnh tinh để tìm ảnh 
Chọn vật kính 
thích hợp để quan 
sát từng loài vsv 
Bước 3: 
o Sau khi quan sát 
xong, tắt đèn,hạ bàn mẫu 
xuống 
o Lấy tiêu bản ra khỏi 
bàn mẫu 
o Vệ sinh các vật kính 
và bàn mẫu cho sạch 
o Đem cất giữ khi sử 
 Vệ sinh sạch kính 
để sử dụng cho 
lần học tiếp theo 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 28 
dụng xong 
PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG 
3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose 
3.1.1. Nguyên tắc 
- Cellulose (C6H10O5)n là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Hằng năm 
có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc dù là chất cao phân tử, khá bền, 
chúng vẫn bị phân giải dưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn 
hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ ẩm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau. 
- Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa 
lớn trong quá trình xử lý môi trường. 
- Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose. Dưới tác dụng 
của enzyme này, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C12H22O11) lại tạo thành 
glucose (C6H12O6) nhờ tác dụng của enzyme celloblase. 
- Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm 
nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. 
3.1.2. Kết quả 
- Kết quả phân tích : 
Tính kết quả: 
Số tế bào/g = N x 
 x n x K=26 x 
 x 10000 x 1= 26.10
5 
(tế bào/g) 
N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào) 
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) 
n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10-4 n=10000) 
K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1) 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 29 
Khuẩn lạc Kích thước Màu sắc Mức độ phân giải Số khuẩn lạc 
Vi khuẩn đỏ 
10-20mm 
Đỏ 5/10 13 
Vi khuẩn 
trắng 
3-5mm 
Trắng 2/10 5 
Vi nấm 
5-10mm 
Đen 3/10 8 
- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ 
- Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được 
- Hình ảnh vi nấm phân giải cellulose, mô tả chi tiết 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 30 
Hình: Vi sinh vật phân giải cellulose ở môi trường Hutchinson 
Hình: vi nấm cellulose 
Nấm tập trung thành từng nhóm nhỏ, mỗi chấm là một khuẩn lạc 
Màu sắc: xanh,đen tầm 0,5-2mm 
Hình dạng: chấm tròn nhỏ 
Có khoảng 26 tế bào trên một đĩa với độ pha loãng 10-4 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 31 
3.1.3. Nhận xét: 
- Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu. 
- Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường để tận dụng hết bề 
mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy . 
- Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để 
tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài. 
3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor 
3.2.1. Nguyên tắc 
- Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyển hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có 
thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoị vi khuẩn sinh axit lên men 
nhiều chất khác nhau. 
- Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối 
phospho khó tan, thường dung Ca3(PO4)2 . Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh 
khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt. 
3.2.2. Kết quả 
 Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3 
- Nồng độ pha loãng 10-2: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được. 
- Nồng độ pha loãng 10-3: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có 
những vòng phân giải trong suốt . 
- Kết quả phân tích : 
Tính kết quả: 
Số tế bào/g = N x 
 x n x K=76 x 
 x 10
3
 x 1 = 76.10
5 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 32 
N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào) 
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) 
n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng 
K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1) 
- Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chi tiết 
3.2.3. Nhận xét: 
- Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm vi 
sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử 
khuẩn của đèn cồn. 
- Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn. 
- Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm 
khác để hoàn thiện bài báo cáo. 
3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 
3.3.1. Nguyên tắc 
- Quá trình nitrit hoá 
NH4
+
 dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để 
biến thành NO2
- 
gọi là quá trình nitrit hoá. NO2
-
 sẽ tác dụng với dung dịch Griss I và 
Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng. 
- Quá trình nitrat 
 NH4
+
 dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để 
biến thành NO3
-
 gọi là quá trình nitrat hoá. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn 
nitrit hoá tạo sản phẩm nitrit NO2
-
 và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO3
- 
. Xác định 
sự hiện diện của NO3
- 
bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản 
ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dich có màu xanh. 
- Quá trình phản nitrat hoá. 
Là quá trình khử NO3
-
 qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng 
của vi sinh vật. Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí. Định tính sự có mặt của nitrat, 
nitrit như trong phần nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thể hiện sự hình thành các bọt 
khí trong môi trường nuôi cấy. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 33 
3.3.2. Kết quả 
3.3.2.1. Vi khuẩn amon trong môi trường lỏng: 
- Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau: 
 Sự đục môi trường 
 Sự tạo bông, cặn 
 Sự nổi váng trên bề mặt 
- Phản ứng sinh hoá: 
 Sự biến đổi màu sắc của giấy thử pH: giá trị pH 
 Sự biến đổi màu của giấy lọc thấm acetate chì 
 So sánh mẫu đối chứng 
Độ pha loãng 
Đục môi 
trường 
Tạo bông Tạo cặn pH 
Màu giấy 
lọc tẩm 
acetate 
Mẫu đối chứng 
Mẫu thí nghiệm     
 Trước Sau 
Hình : ống nghiệm amon hóa 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 34 
 Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của giấy pH 
- Sau vài ngày,trong quá trình nuôi cấy không ngừng sinh ra bọt khí và trên bề mặt 
môi trường có một lớp bọt khí. Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO3
-
 và sinh ra 
khí N2. 
3.3.2.2. Vi khuẩn nitrat hoá: 
- Phản ứng định tính nitrit: 
Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng. 
Nhỏ 1 giọt dung dịch Griess I, Griess II : màu hồng 
- Chọn ống nghiệm dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. 
- Mô tả,so sánh các hình thái tế bào vi khuẩn quan sát được về: hình dạng,khả năng 
di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 35 
Hình: Sự đổi màu của vi khuẩn Nitrat 
3.3.2.3. Vi khuẩn phản Nitrat hoá: 
3.3.3. Nhận xét: 
- Ở quá trình phản nitrat hóa : NO3
-
 được khử đến N2O và N2. Sự giải phóng N2 là sản 
phẩm ưu thế của quá trình phản nitrat. Vì N2 hòa tan ít trong nước,do đó chúng có 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 36 
khuynh hướng thoát ra ngoài như các bong bóng nổi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trên 
bề mặt môi trường nên không khí bên ngoài không vào được và nito bên rong môi trường 
cũng không thoát ra ngoài được. Trong quá trình thí nghiệm cần thao tác cẩn thận tránh 
để không khí bên ngoài vào. 
- Ở quá trình nitrat hóa: sự đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động của 
vi khuẩn mạnh. 
3.4. E.coli,Coliform 
3.4.1. Nguyên tắc 
- Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms 
phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable 
number). 
- Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy nồng độ thập 
phân; 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm có môi 
trường thích hợp có ống Durham bẫy khí. Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. 
- Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm, đây 
là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ 
pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện 
diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 
3.4.2. Kết quả 
Nồng độ Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 
Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3 
Kết quả + + + + + + + + + 
 3 3 3 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 37 
Nồng độ 
Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 
Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3 
Kết quả + + + + + + + + + 
 3 3 3 
Hình ảnh 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 38 
Hình ảnh 
E.coli 
Do mẫu bị nhiễm vi sinh vật nên không có kết quả và hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi 
Coliform 
Làm tiêu bản và hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi 
Hình: nhuộm đơn Coliform 
3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: 
3.5.1. Nguyên tắc 
3.5.1.1. Nguyên tắc xác định Clostridium 
- Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử, phần lớn 
di động, có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 39 
Những loài thuỷ giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành 
acetic axid, butyric acid mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết các giống Clostridium 
thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuyy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài 
khác thuộc nhóm ưa lạnh. 
- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri 
ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1-2 ngày. Nếu nghi ngờ có 
Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc 
Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2
-
) và ion (Fe2
+
) có trong môi 
trường. 
3.5.1.2. Nguyên tắc xác định Streptococcus phân 
- Streptococcus phân (Feacal Streptococcus) là các liên cầu khuẩn, có nguồn gốc từ phân, 
có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập thành từng đôi hay từng 
chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các ;oài 
này sống hiếu khí tuỳ ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí, tiết bacteriocin trong 
quá trình tang trưởng và có thể ức chế sự tang trưởng của các vi khuẩn khác. 
Streptococcus được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân của môi trường nước. 
- Có thể xác định Septoccus phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc phương pháp 
MPN. 
- Phương pháp đếm khuẩn lạc 
Mẫu được cấy trên bề mặt môi trường chọn lọc, sau khi ủ đếm khuẩn lạc đặc trưng và 
khẳng định các khuẩn lạc đã đếm bằng các thử nghiệm sinh hoá. Trong trường hợp nghi 
ngờ có sự hiện diện của Streptococcus phân nhưng có thể bị tổn thương, tiến hành hồi 
phục các vi khuẩn này bằng cách cấy mẫu vào trong môi trường không chọn lọc, ủ ở 
37
o
C trong 2 giờ, sau đó phủ lên một lớp môi trường chọn lọc, các đĩa môi tường sau khi 
cấy được ủ ở 44oC trong khoảng 48 giờ. 
- Phương pháp MPN 
Dịch mẫu được cấy vào môi trường canh Azide Glucose. Stretococcus phân có khả năng 
sinh trưởng trong môi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất 
chỉ thị pH trong môi trường. Tất cả các ống cho kết quả dương tính sẽ được cấy tiếp sang 
môi trường khẳng khác. Môi trường khẳng định được sử dụng Bile Esculine Agar. 
Streptococcus phân thuỷ phân esculine trong môi trường tạo ra sản phẩm cuối cùng là 
6,7-hydroxycoumarin, chất này kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 40 
khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, việc khẳng định còn được thực hiện bằng thử 
nghiệm bằng thử nghiệm catalase. 
3.5.2. Kết quả 
- Mỗi mẫu nước trong bề aerotank, SBR thực hiện làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển 
vi. 
 Mẫu ban đầu 2h 
 4h 6h 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 41 
 8h 
- Chụp hình vi sinh vật 
Mẫu 0h Mẫu 4h 
Mẫu 2h Mẫu 8h 
3.5.3. Nhận xét 
- Mẫu nước thải ban đầu rất ô nhiễm, mẫu nước có màu đen, có mùi hôi kho chịu 
- Sau khi cho sục khi thì mẫu nước trong hơn , cặn lơ lửng ít và lắng xuống đáy 
như hình 2 
- Tiếp tục làm như vậy ta được hình 3,4,5 màu nước trong, không có mùi, ít cặn lơ 
lửng, các bông cặn lớn dần và bị lắng xuống thành bùn 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 42 
- Từ đó cho thấy, khi cho sục khí vào thì xuất hiện các vi sinh vật trong nước thải 
hoạt động, và nhờ đó mà chất lượng nước đã thay đổi 
 - Nước thải càng sục khí lâu thì càng có nhiều vi sinh vật và kích thước lớn 
- Có ít vi sinh vật trong mẫu quan sát. 
- Có những vi sinh vật hình bầu dục có thể di chuyển nên không chụp lại được hình ảnh 
của chúng 
- Máy ảnh chụp không rõ nét 
- Kính hiển vi cũ nên hình ảnh soi được không đẹp 
- Không thể xác định được số lượng vi sinh vật và tên của chúng. 
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
4.1. Kết luận 
Sau môn học sinh viên nắm được các bước tiến hành của từng thí nghiệm. 
Có kinh nghiệm trong việc thưc hành. 
Nội dung bài liên kết với nhau dễ hiểu. 
Nội dung thí nghiệm các phương pháp và các bước tiến hành được trình bày kĩ. 
 Các thiết bị thí nghiệm có một số khuyết điểm rõ ràng. Nhiều bài không tiến hành được 
các thí nghiệm nghiên cứu và kiến thức chuyên môn còn hạng hẹp các nhận định trong 
bài chỉ mang tính chất dự đoán, định tính mà không có kết quả chính xác. Do đó kết quả 
nhóm đưa ra chưa chuẩn xác. Rất mong được sự góp ý sữa chữa của thầy để kiến thức 
của sinh chúng tôi thêm hoàn thiện. 
 Tuy kết quả chưa cao nhưng chúng tôi biết cách thao tác thí nghiệm và kiểm nghiệm 
kiến thức 
4.2. Kiến nghị 
Nếu trường có đầy đủ các dụng cụ thí nghiệm, phòng học bộ môn thì sinh viên sẽ suy 
nghĩ và làm việc độc lập nhằm phát triển hơn về năng lực cá nhân của sinh viên 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 43 
4.3. Bài học kinh nghiệm 
Trong quá trình rèn luyện khả năng làm thí nghiệm thực hành nhóm đã rút ra một số 
kinh nghiệm sau: 
• Khi làm thí nghiệm phải nắm được mục đích thí nghiệm. 
• Nắm chắc các bước tiến hành thí nghiệm. Thao tác thí nghiệm cẩn thận chính xác. 
Tránh tình trạng làm đi làm lại nhiều lần làm mất tính thuyết phục. 
• Dự đoán kết quả trước khi làm thí nghiệm để sau đó tiến hành thí ngiệm rồi so 
sánh kết quả. 
• Sinh viên tự biết bố trí thí nghiệm và thấy được kết quả làm ra. 
• Sinh viên tự biết khám phá kiến thức, tự tìm kiến thức trong tâm cho mình để ghi 
nhớ để tránh việc ghi nhớ máy móc mà hiểu sâu về vấn đề hơn, khả năng diễn đạt rõ 
ràng. 
(Hình ảnh các thành viên trong nhóm) 
Họ và tên Hình ảnh 
Ngô Thái Bảo 
Trần Thị Hồng Cẩm 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 44 
Trần Thiên Ân 
Nguyễn Dũ 
Nhóm 1 
Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 45