Bài giảng Vi sinh vật học đại cương - Chương 6: Những vấn đề kỹ thuật và phương pháp tạo giống vi sinh vật - Trịnh Ngọc Nam

NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG VI SINH VẬT 
Chương VI: 
I. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG 
 Sản lượng cao , thuần khiết , dễ tách 
 Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền , dễ tìm 
 Thuần chủng 
 Khỏe , phát triển nhanh 
 Có khả năng chống tạp nhiễm 
 Dễ bảo quản , ổn định 
 Có khả năng cải tạo 
I. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG 
Các trung tâm giữ giống vi sinh vật 
 ABBOTT: Abbott Laboratories, North Chicago, III.60064, USA. 
 ATCC: American Type Cultur Collection, 12301, Parklawn Drive Rockvill Md 20852, USA. 
 CANAD – 212: Division Obioscience , National Research Council, Ottawa, Canada. 
 CC: CRISO Division of Plant Industry, Canberra City, A.C.T. Australia. 
 FERM: Fermentation Reseach institute, Agency of IndustrialScience and Technology, Ministry of Industrial Trade and industry, Chiba, Japan. 
 HIR: Food and Fermentation Division, Hokkaido Profectural Industrial Research Institute, Sapporo, Japan. 
 IMASP: Museum of Culture, Institute of Microbiology, Academy of Science of Republic of China Peking, China. 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG 
 Phân lập 
 Đột biến nhân tạo 
 Lai tạo gen 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 
1.   Chọn hộp petri chứa : 45 colonies ( thuộc ống nghiệm thứ 2). 
2.   Tổng độ pha lõang của ồng nghiệm thứ 2 là 
 1/10 2 (99+1) ( ống nghiệm 1)x 1/10 (= 10/(10+90) ( ống nghiệm 2)  =  1/10 3 
3.   Lượng mẫu dùng để đổ đĩa là = 0.1ml = 1/10. 
 Vậy lượng VSV có trong mẫu là : 
Tính lượng VSV sau khi pha lõang 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 
Bài tập 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 
Đổ đĩa 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 
Cấy ria 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN 
Loại đột biến 
Bản chất các thay đổi 
Dấu hiệu phát hiện đột biến 
Không di động 
Mất tiên mao , hoặc tiên mao không hoạt động 
Các khuẩn lạc mọc dính vào nhau . 
Không tạo nha bào 
Mất hoặc thay đổi bề mặt màng nhầy 
Khuẩn lạc bé , xù xì thay vì lớn , tròn , bóng . 
Khuẩn lạc xù xì 
Mất hoặc thay đổi lớp bên ngoài lipopolysaccharide 
Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ , không đều 
Dinh dưỡng 
Mất một hoặc nhiều enzym trên con đường sinh tỏng hợp 
Không mọc trên môi trường tổng hợp tối thiểu 
Lên men đường 
Mất enzym phân giải các loại đường 
Không tạo ra sự biến đổi màu trên môi trường đặc trưng với chỉ thị màu đặc trưng . 
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN 
Loại đột biến 
Bản chất các thay đổi 
Dấu hiệu phát hiện đột biến 
Kháng thuốc 
Thay đổi khả năng thẩm thầu , ngăn cản sự xâm nhập vào tế bào của các loại thuốc , hoặc phá hủy các thuốc . 
Mọc trên môi trường có thuốc ở nồng độ mà bình thường có thể gây ức chế phát triển của vi sinh vật . 
Kháng virút 
Mất điểm tiếp nhân virút 
Phát triển trên môi trường nuôi cấy khi có mặt virút ở nồng độ cao . 
Nhạy cảm với nhiệt độ bình thường 
Thay đổi một protein thiết yếu làm tăng sự nhạy cảm với nhiệt độ 
Có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp . Nhưng ở nhiệt độ bình thường không phát triển . 
Mất sắc tố 
Mất các enzym có khả năng tham gia tổng hợp sắc tố 
Khuẩn lạc có màu khác hoặc mất màu 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới : 
 Sử dụng thạch nghiêng . 
 Nấm mốc : cấy truyền sau 3 – 6 tháng 
 Nấm men, vi khuẩn : cấy truyền sau 1 – 2 tháng 
 Ưu điểm : đơn giản , dễ làm . 
 Nhược điểm : tốn công sức , môi trường , thời gian . Không ổn định 
Coccidioides immitis 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới : 
 Phương pháp làm : 
 Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên thạch đĩa . 
 Cấy vi sinh vật điển hình lên thạch nghiêng . 
 Nuôi trong tủ ấm . 
 Lấy ống giống ra và cho vào tủ lạnh bảo quản ở 4 0 C. 
 Định kỳ cấy truyền lại . 
 Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào để tránh mất nước 
Actinomycetes 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng : 
Campylobacter jejuni 
 Sử dụng dầu khoáng như vaselin , parafin .. 
 Ưu điểm : 
 Đơn giản , hiệu quả cao . 
 Môi trường không bị mất nước . 
 Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với phương pháp 01. 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng : 
 Cách bảo quản : 
 Khử trùng dầu khoáng (121 0 C, 2h). 
 Sấy khô (170 0 C, 1 – 2h) 
 Để nguội . 
 Đổ lên môi trường thạch nghiêng có VSV phát triển tốt khỏang 1cm. Đậy nút bông lại . 
 Trét parafin đặc lên miệng 
 Giữ ở điều kiện lạnh hoặc điều kiện thường . 
Serratia 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên đất , cát : 
 Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử . 
 Thời gian bảo quản từ 1 - nhiều năm . 
 Trước khi dùng phải : 
 Cấy ria lên môi trường agar 
 Chọn các khuẩn lạc điển hình ... 
Aspergillus 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên đất , cát : Cách làm : 
 Đất hoặc cát đem rây kỹ , lấy hạt cùng cỡ . 
 Ngâm trong HCl hoặc H 2 SO 4 đậm đặc 8 – 12h 
 Với đất chua thì trung hòa bằng CaCO 3 1 – 2%. 
 Rửa đến pH trung tính . 
 Sấy khô , thanh trùng và giữ vô trùng . 
 Đổ cát vào ống nghiệm chứa VSV trên thạch ( nhiều bào tử ), lắc đều . 
 Rót cát lẫn vi sinh vật và bào tử sang ống nghiệm vô trùng khác . 
 Đậy nút bông giữ ở 40 0 C trong 2 – 3 ngày . 
 Hàn kín ống nghiệm bằng paraffin. 
 Để trong phòng mát hoặc ở 4 0 C. 
Clostridium 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên hạt 
 Bảo quản các vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không . 
 Thời gian bảo quản có thể lên tới 1 năm .. 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Phương pháp giữ giống trên hạt 
 Phương pháp làm : 
 Hạt ngũ cốc được rửa sạch bằng nước nóng . 
 Cho vào các ống nghiệm . 
 Phủ trên các hạt này một lớp bông thấm nước 
 Nấu hạt ngũ cốc . 
 Thanh trùng hạt ở 121 0 C trong 40 phút . 
 Thanh trùng 3 lần , mỗi lần cách nhau 24h. 
 Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy . 
 Hằng ngày lắc nhẹ . 
 Sau 8 – 10 ngày kiểm tra lại . 
 Gắn paraffin. 
 Giữ ở nhiệt độ 15 – 20 0 C. 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
Giữ giống trên giấy lọc : 
 Bảo quản các vi sinh vật có bào tử . 
Thời gian bảo quản nhiều năm . 
Cách làm 
 Giấy lọc cắt miếng 1-3 cm. Cho vào ống nghiệm . 
 Đậy nút bông , thanh trùng ở 121 0 C, 1 giờ . 
 Sấy ở 100 0 C, 3 giờ . 
 Vi sinh vật nuôi trong 3 – 5 ngày để có bào tử . 
 Cho vào mỗi miếng giấy lọc 1 giọt vi khuẩn . Nuôi thêm 2 – 3 ngày . 
 Phủ paraffin đặc đun chảy lên nút bông . 
 Để tủ lạnh hoặc nơi mát . 
Clostridium 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
 Giữ giống trên các miếng gelatin: 
 Môi trường gelatin: 
 nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit 
 nước thịt + 10% gelatin + 0,25% acid ascorbic. 
 Cho vi sinh vật vào môi trường . Nuôi một thời gian . 
 Nhỏ môi trường chứa vi sinh vật lên giấy nến trong hộp petri . 
 Sấy khô trong tủ hút chân không , dùng P 2 O 5 hấp thụ nước . 
 Bỏ trong ống nghiệm . 
 Giữ ở 5 0 C. 
 Khi sử dụng nuôi trong broth thích hợp . Cấy vào agar, chọn khuẩn lạc . 
Yersina 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
 Phương pháp lạnh đông : 
 Phương pháp làm đơn giản 
 Vi sinh vật giữ được lâu 
 Cách làm : 
 Trộn vi sinh vật và các chất bảo vệ vào lẫn với nhau 
 Cho vào ống nghiệm , làm lạnh từ từ . 
 Chất bảo vệ : 
 glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính 
 huyết thanh ngựa + geletin 1% + pH trung tính 
 saccharose 10% + geletin 1% + pH trung tính 
 dung dịch glucose 10%, 
 dung dịch lactose 10%). 
Sarcina 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
 Phương pháp lạnh đông : 
 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 15 0 C – (-) 20 0 C : 6 tháng cấy truyền một lần . 
 Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 30 0 C : 9 tháng cấy truyền một lần . 
 Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 40 0 C : 1 năm cấy truyền một lần 
 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 50 0 C – (-) 60 0 C : 3 năm cấy truyền một lần 
 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 70 0 C – (-) 60 0 C : 10 năm cấy truyền một lần 
E. coli 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
 Phương pháp đông khô : 
 Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp . 
 Làm giảm hoặc làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật . 
 VSV không bị biến đổi về các đặc tính di truyền 
 Thời gian lưu giữ lâu lên tới vài chục năm . 
 Đuợc dùng nhiều trong sản xuất . 
Nấm men 
II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT 
 Phương pháp đông khô : 
 Sau khi nuôi cấy , vi sinh vật được trộn với chất bảo vệ , 
 Phân vào ống nghiệm 
 Cho vào chậu lạnh ở nhiệt độ (-)70 – (-)80 0 C, trong 1 – 5 phút . 
 Đưa vào thiết bị đông khô (p= 10-4Hg, 8 – 14 giờ ). 
 Sau khi làm khô , độ ẩm còn 1 – 4%. 
 Kiểm tra lại hàm lượng ẩm bằng giấy tẩm CoCl 2 3%. 
 Hàn kín ống nghiệm khô . 
 Bảo quản ở nhiệt độ phòng . 
Vibrio