Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tính ổn định của DNA (DNA replication)

Trịnh Thị Thu Thủy 
BM: SHPT & CNVS Khoa CNSH 
Chương IV: Tính ổn định của DNA 
(DNA replication) 
TÁI	
  BẢN	
  GEN	
  (DNA	
  REPLICATION)	
  
•  Tái bản đảm bảo tính đặc trưng ổn định của mỗi 
loài và truyền đạt thông tin di truyền qua các thế 
hệ. 
TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA DNA 
Cấu trúc: 
 - 2 mạch xoắn kép bổ xung 
 - Cấu tạo hóa học các nucleotide 
Hoạt động: 
 - Cơ chế tái bản: sao chép thông tin di truyền từ 1 thành 2 bản 
 - Cơ thế kiểm tra, sửa chữa sai sót 
I.	
  NGUYÊN	
  TẮC	
  CHUNG	
  CỦA	
  TÁI	
  BẢN	
  
•  Tái bản là việc sao chép thông tin từ sợi 
DNA ban đầu. Kết quả là tạo ra 2 sợi DNA 
giống hệt nhau. 
•  Tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn 
(semi-conservative): Một sợi cũ làm khuôn, 
tổng hợp thêm 1 sợi mới. 
–  Do Watson & Crick dự đoán 
– Được chứng minh bởi Meselson và Stahl 
(1958) 
1.THÍ	
  NGHIỆM	
  MESELSON-­‐STAHL	
  
•  Đối tượng: E.coli 
•  Phương pháp: Đánh dấu đồng vị phóng xạ 
N15 kết hợp li tâm siêu tốc (ultra-
centrifuge) 
•  Thực hiện 
1.  Nuôi E.coli trên môi trường có N15 
(nặng) 
2.  Chuyển sang môi trường có N14 (Nhẹ) 
3.  Tiến hành thu tế bào sau 1, 2, 3 thế hệ 
và li tâm để xác định tỉ trọng. 
•  Trước khi li tâm trộn dịch tế bào với CsCl 
•  Tỷ trọng xác định theo 3 mức 
–  Nặng: Gồm N15 
–  Trung bình: gồm N14 và N15 
–  Nhẹ: gồm N14 
SƠ	
  ĐỒ	
  THÍ	
  NGHIỆM	
  MESELSON-­‐STAHL	
  
Thí nghiệm của Matthew 
Meselson và Franklin Stahl 
(1958) 
Sự tái bản theo nguyên tắc bản bảo thủ 
Nguyên tắc bán bảo 
thủ: giữ lại một mạch 
đơn cũ và một mạch 
đơn mới được tổng hợp 
Kết	
  quả	
  
•  Ban đầu: 100% sợ nặng 
•  Sau 1 thế hệ: 100% sợi trung bình 
•  Sau 2 thế hệ: 50% sợi trung bình, 50% sợi 
nhẹ 
•  Sau 3 thế hệ? 
•  Sau 4 thế hệ?? 
2.CÁC	
  NGUYÊN	
  TẮC	
  CHUNG	
  CỦA	
  TÁI	
  BẢN	
  
•  Tái bản theo kiểu bán bảo toàn và gián 
đoạn 
•  Sự tái bản bắt đầu tại một hoặc nhiều vị trí 
đặc biệt trên phân tử DNA và diễn ra theo 2 
hướng ngược nhau. Điểm bắt đầu gọi là 
điểm khởi đầu tái bản (ori) 
•  Mỗi chạc tái bản gọi là một đơn vị tái bản 
•  Tại mỗi chạc tái bản đầu tiên diễn ra quá 
trình tổng hợp mồi (do các DNA 
polymerase không có khả năng tự kéo dài) 
•  Do sự tổng hợp DNA luôn diễn ra theo 
chiều 5’-3’ nên sự tổng hợp trên 2 sợi 
khuôn là không giống nhau, một sợi nhanh 
và một sợi chậm. 
ĐIỂM	
  KHỞI	
  ĐẦU	
  TÁI	
  BẢN	
  
Mô hình chung 
II. Tái bản DNA ở 
prokaryote 
-  Xảy ra chỉ ở 1 điểm trên phân tử DNA vòng của prokaryote 
-  vùng DNA được sao chép từ 1 điểm khởi đầu được gọi là đơn vị 
tái bản-replicon 
CÁC	
  ENZYME	
  THAM	
  GIA	
  TÁI	
  BẢN	
  
•  Protein nhận biết và bám vào điểm khởi 
đầu tái bản (ori) để hình thành phức hợp 
mở (ở E.coli là dnaA) 
•  DNA gyrase: mở cuộn DNA siêu xoắn phía 
trước mỗi chạc tái bản 
•  Helicase: tháo xoắn các sợi DNA mạch 
kép, hình thành các vùng sợi đơn (ở E.coli 
là dnaB) 
•  Primase: Tổng hợp các đoạn mồi RNA (ở 
E.coli là protein dnaG 
CÁC	
  ENZYME	
  THAM	
  GIA	
  TÁI	
  BẢN	
  (Nếp)	
  
•  Protein SSB (single strand binding protein): 
bám vào vùng DNA sợi đơn do Helicase 
tách ra, giữ tạm thời không cho DNA xoắn 
lại. 
•  DNA polymerase III: là enzyme chính tham 
gia quá trình tổng hợp DNA, có hoạt tính 
polymerase 5’-3’ và hoạt tính exonuclease 
3’-5’ 
CÁC	
  ENZYME	
  THAM	
  GIA	
  TÁI	
  BẢN	
  (Nếp)	
  
•  DNA polymerase I: vừa cắt bỏ dần đoạn 
mồi RNA nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’, 
vừa kéo dài đoạn Okazaki để lấp chỗ trống 
(ở E.coli là DNA polymerase) 
•  DNA ligase: Nối các đoạn Okazaki với nhau 
tạo thành đoạn liên tục 
Tái bản DNA ở prokaryote 
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
1.  Topoisomerase: tháo xoắn dạng DNA siêu xoắn thành dạng thẳng 
Topoisomerase	
  
Topoisomerase I: gắn vào DNA và cắt một trong hai sợi đơn. 
Sau khi tạo được DNA thẳng thì enzyme này nối chỗ đứt lại 
Topoisomerase II: Cắt cả hai mạch của phân tử DNA 
(gyrase của E.coli) 
Tạo chạc tái bản 
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
v  Helicase: phá vỡ liên kết hydro giữa các bazơ trên 2 
sợi đơn bổ sung 
Tái bản DNA ở prokaryote 
- Một số gắn trên 
mạch theo hướng 
3’-5’ : các protein 
của gen Rep 
-  Một số khác gắn 
t r ê n m ạ c h t h e o 
h ư ớ n g 5 ’ - 3 ’ : 
helicase II và III 
Tái bản DNA ở prokaryote 
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
v DNA polymerase: 
 + DNA pol I: tổng hợp lấp chỗ trống khi đoạn mồi 
tách ra 
 DNA polymerase I chỉ chứa một chuỗi polypeptide 
 + DNA pol II: có chức năng đọc sửa 3’ – 5’ 
exonuclease, kéo dài chuỗi 
 + DNA polymerase III : là một holoenzyme phức 
chứa 7 polypeptide khác nhau (α, β, 2γ, δ, ε, µ, 2θ) tổng 
hợp mạch bổ sung từ đầu 3’OH tự do của mỗi mồi RNA 
Tái bản DNA ở prokaryote 
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
v  SSB: protein gắn sợi đơn, 
làm 2 mạch đơn không kết 
hợp lại với nhau 
v ligase: nối tất cả các chỗ 
gián đoạn trên mạch mới. 
đơn vị sao chép ở SV tiền nhân (replicon)	
  
đứt	
  tại	
  một	
  điểm	
  của	
  1	
  trong	
  2	
  mạch	
  đơn	
  DN đứt tại một điểm của 1 
trong 2 mạch đơn DNA A	
  
Tái bản DNA ở prokaryote 
-  Cắt tại một điểm của 1 trong 2 mạch đơn DNA 
-  Tại điểm bắt đầu tái bản: thường nằm ở những vùng 
DNA có chứa nhiều trình tự AT (100 - 200bp) 
CƠ	
  CHẾ	
  TÁI	
  BẢN	
  Ở	
  E.coli	
  
•  Là đại diện của tế bào Prokaryote 
•  Quá trình tái bản là cơ chế phức tạp 
có sự tham gia của nhiều yếu tố. 
•  Gồm 3 giai đoạn 
–  Giai đoạn khởi đầu 
–  Giai đoạn kéo dài 
–  Giai đoạn kết thúc 
GIAI	
  ĐOẠN	
  KHỞI	
  ĐẦU	
  (iniNaNon)	
  
•  Bắt đầu từ điểm khởi đầu tái bản Ori 
–  Các protein nhận biết điểm Ori được 
tổng hợp, bám vào sợi sợi DNA tạo cấu 
trúc nucleoprotein 
–  Cấu trúc này mở xoắn vùng DNA giàu 
AT để hình thành phức hợp mở 
–  Hai phân tử Helicase chui vào mở xoắn 
tạo 2 chạc tái bản (replication fork) 
CHẠC	
  BA	
  TÁI	
  BẢN	
  Ở	
  NST	
  VÒNG	
  
•  1. Nhiễm sắc thể dạng 
vòng ở vi khuẩn 
•  2. Khởi đầu tái bản với 
2 chạc tái bản 
•  3,4. Hình thành cấu 
trúc dạng theta. 
CHẠC	
  BA	
  TÁI	
  BẢN	
  
KHỞI	
  ĐẦU	
  (Nếp)	
  
–  Khi 2 sợi đơn tách ra, các protein SSB 
bám vào để giữ sợi DNA không bị xoắn 
trở lại 
–  Quá trình tổng hợp sợi mới bắt đầu bằng 
việc tổng hợp các đoạn mồi RNA do 
Primase 
•  Mồi thường dài 10-12nu 
GIAI	
  ĐOẠN	
  KÉO	
  DÀI	
  (elongaNon)	
  
•  Sự kéo dài chuỗi trên cả 2 mạch là 
khác nhau. (nhắc lại: DNA luôn được 
tổng hợp theo chiều 5’-3’) 
•  Enzyme then chốt cho quá trình kéo dài 
là DNA polymerase III 
•  Tốc độ tái bản ở E.coli khoảng 1000nu/
giây 
KÉO	
  DÀI	
  TRÊN	
  SỢI	
  KHUÔN	
  3’-­‐5’	
  
•  Primase tổng hợp một đoạn mồi RNA có 
đầu 3’-OH 
•  DNA polymerase III kéo dài sợi DNA mới 
theo chiều 5’-3’ một cách liên tục 
•  Sợi mới được tổng hợp gọi là sợi liên tục 
hay leading strand 
TỔNG	
  HỢP	
  2	
  SỢI	
  MỚI	
  
•  Sợi khuôn 3’-5’: 
tổng hợp liên tục 
•  Sợi khuôn 5’-3’: 
tổng hợp gián đoạn 
•  Chiều dịch chuyển 
chạc 3 tái bản cùng 
chiều với DNA 
polymerase III trên 
sợi nào? 
KÉO	
  DÀI	
  TRÊN	
  SỢI	
  KHUÔN	
  5’-­‐3’	
  
•  Quá trình tổng hợp diễn ra chậm, cần tổng 
hợp nhiều đoạn mồi. 
•  Các đoạn mới được tổng hợp theo chiều 
5’-3’ gọi là các đoạn Okazaki 
•  Chiều dài mỗi đoạn Okazaki 1000-2000 nu 
•  Sợi mới được tổng hợp gọi là sợi chậm hay 
lagging strand 
•  Cần sự tham gia của nhiều enzyme 
Các	
  enzyme	
  tham	
  gia	
  tổng	
  hợp	
  trên	
  sợi	
  khuôn	
  5’-­‐3’	
  
•  Primase tổng hợp mồi RNA 
•  DNA polymerase III kéo dài đoạn Okazaki 
•  DNA polymerase I cắt bỏ dần đoạn mồi 
RNA và lấp dần khoảng trống vừa cắt bằng 
DNA 
•  Ligase nối các đoạn Okazaki lại với nhau 
3 giai đoạn hoàn thiện 
nối các đoạn Okazaki 
- Phân hủy đoạn mồi 
RNA (enzyme gì? 
- Lấp đầy khoảng 
trống bằng cách kéo 
dài các đoạn Okazaki 
(enzyme gì?) 
- Nối các đoạn 
Okazaki lại với nhau 
(enzyme gì?) 
Quá trình tái bản 
1.  Topoisomerase: Tháo xoắn tạo 
DNA thẳng 
Ø  Vị trí khởi đầu tái bản: nằm ở 
những vùng chứa nhiều trình tự AT 
(100 – 200bp) 
2. Helicase: Phá vỡ liên kết 
hydro trên hai mạch đơn 
3. SSB protein (single strand 
binding protein) 
Bám vào các sợi đơn đang 
được kéo dài hai mạch 
đơn không kết hợp lại với 
nhau 
Topoisomerase 
Helicase SSB protein 
Topoisomerase 
Helicase SSB protein 
Quá trình tái bản 
4. RNA primase tổng hợp mồi cho 
việc tái bản 
Đoạn RNA mồi: 8 – 12 nu 
5. Hệ DNA polymerase tham 
gia kéo dài chuỗi và đọc sửa 
trên hai sợi đơn 
6. Ligase: Nối tất cả các chỗ 
gián đoạn trên mạch mới 
RNA 
primase 
DNA 
polymerase 
DNA ligase 
Tái bản DNA ở prokaryote 
Hướng tổng hợp trên hai sợi đơn 
1. Trên mạch khuôn hướng 3’ – 5’: 
sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn 
ra liên tục gọi là mạch tiến 
( leading) 
2. Trên mạch khuôn 5 – 3’ : 
Sinh tổng hợp diễn ra không 
liên tục mà dưới dạng ngắn gọi 
là đoạn Okazaki (mạch chậm – 
lagging) 
Kích thước đoạn Okazaki: 1000 
– 2000bp 
Topoisomerase 
Helicase SSB protein 
RNA 
primase 
DNA 
polymerase 
DNA ligase 
VẤN	
  ĐỀ	
  KẾT	
  THÚC	
  TÁI	
  BẢN	
  
•  Do khác nhau về đặc điểm cấu tạo nên vấn 
đề kết thúc ở Prokaryote và Eukaryote là 
khác nhau. 
Kết	
  thúc	
  ở	
  Prokaryote	
  
•  Khi chạc ba tái bản gặp vị trí kết thúc đặc 
thù gọi là các điểm kết thúc tái bản 
(replication termination) 
•  Ở vùng kết thúc tái bản có các protein kết 
thúc tái bản (replication termination protein 
– RTP). 
•  Phức hợp DNA- Protein này ngăn cản sự 
dịch chuyển của chạc ba tái bản 
•  Ở E.coli RTP có KLPT 36kDa 
•  Ở Bacillus subtilis gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu 
phần 14,5kDa 
Bidrec'onal	
  DNA	
  
synthesis	
  
Replica'on	
  
forks	
  will	
  
merge	
  
Tái bản DNA ở Eukaryote 
Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể kép 
-  Diễn ra tại kỳ trung gian (S phase) giữa 2 lần phân bào. Tế bào nhân đôi chỉ 
sau khi DNA tái bản 
-  Sự tái bản xảy ra tại nhiều điểm trên nhiễm sắc thể. VD ở bộ NST người có 
20.000-30.000 đơn vị tái bản, chiều dài một replicon từ 100 đến 200 kb 
Tái bản DNA ở Eukaryote 
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
1.  Polymerase α/ primase: tổng hợp mồi RNA cho mạch chậm 
Không có khả năng đọc sửa (exonuclease) 
2. Polymerase β: tương tự như polymerase I ở sinh vật tiền nhân 
Tổng hợp đi liền với sửa chữa và hoàn chỉnh sợi đơn mới	
  	
  
3. Polymerase γ: được tìm thấy ở ty thể nhưng chưa rõ chức năng 
4. Polymerase δ: tương tự như DNA pol III ở sinh vật tiền nhân 
Tổng hợp sợi đơn mới 
5.	
  Polymerase ε: mới được phát hiên , chưa rõ chức năng	
  
Tái bản DNA ở Eukaryote 
6. Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) 	
  
 nhân tố kết gắn nhiễm sắc + protein β tổ chức lắp ghép trung 
 gian PCNA (Proliferating cell nuclear antigen ) 
Chức năng: tháo bỏ và lắp ghép lại các protein nằm trong nucleosome	
  
Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép	
  
7. Các nhân tố sao chép A và C (Replication Factor) RF-A, RF-C 
Chức năng: cần cho hoạt động của các DNA polymerase α và β 
Newly	
  made	
  
histone	
  proteins	
  
PCNA:	
  gồm	
  3	
  protein	
  
Tái bản DNA ở Eukaryote 
1. Dưới tác dụng của Topoisomerase và nhân tố tái bản RF-A, 
phức hợp nhận biết vùng khởi đầu tái bản (origin recognition 
complex – ORC) bọc lấy điểm khởi đầu (giàu AT) 
DNA được tháo xoắn 
2. Trên mạch chậm:Primase tương tác với RF-A tổng hợp các mồi 
RNA (10nu) kéo dài thêm 20 nu nhờ nhân tố RF-C kết hợp với 
Pol α 
- Pol δ gắn vào chuỗi và tổng hợp đoạn Okazaki 
3.	
  Pol α chuyển đến mạch đối diện và tổng hợp liên tục mạch tiến	
  	
  
Mô hình tái bản ở Eukaryote 
Tái bản DNA ở Eukaryote 
4. Kết thúc tổng hợp tại đầu telomere của nhiễm sác thể 
Đầu cuối của DNA (telomere) có chứa nhiều đoạn lặp lại giống 
nhau, trình tự đoạn lặp TTAGGG hay TTGGGG 
Cấu trúc đầu so le 3’ (overhang): có chiều dài 12-16 nu 
Sự	
  liên	
  quan	
  giữa	
  đầu	
  telomere	
  của	
  nhiễm	
  sắc	
  thể	
  đến	
  tuổi	
  thọ?	
  
Cơ chế kéo dài đầu telomere 
Telomerase RNA đóng vai trò 
 quan trọng 
III.	
  CƠ	
  CHẾ	
  SỬA	
  SAI	
  TRONG	
  QUÁ	
  TRÌNH	
  TÁI	
  BẢN	
  
•  Sửa chữa DNA là thuộc tính của mọi tế bào 
sống 
•  Sai sót tự nhiên khi tái bản là 10-5 
•  Sai sót khi kết thúc tái bản là 10-9 
•  Các nu gắn sai trong quá trình tái bản được 
DNA polymerase cắt bỏ thay thế bằng nu 
thích hợp 
•  Cơ chế sửa sai ở prokaryote đã được sáng 
tỏ, ở eukaryote vẫn còn được nghiên cứu. 
HỆ THỐNG SỬA CHỮA SAI SÓT KHI TÁI BẢN 
1.  Cơ chế phòng ngừa: 
Trong tế bào có hệ thống ngăn chặn tác hại của các chất chuyển 
hóa trong tế bào: 
Ví dụ: 
v hệ thống điều hòa cân bằng acid – bazo (thông qua kênh vận 
chuyển) 
v Hệ thống khử: NADH, NADPHH+ 
2. Cơ chế đảm bảo sự trung thành trong tái bản 
v  Cơ chế đọc sửa của các DNA pol I và Pol III: 
Cắt bỏ bazo lắp ghép sai rồi thay thế bằng bazo đúng bổ sung 
v C ơ c h ế h o ạ t 
quang: exonuclease 
dưới tác dụng của 
ánh sáng ở bước 
sóng 300nm sẽ cắt bỏ 
Thymine dimer gây 
bởi tia UV ra khỏi 
phân tử DNA 
v Sửa chữa bằng tái tổ hợp: 
Cơ chế: Trao đổi chéo chính xác 
giữa đoạn có sai sót với đoạn 
không sai sót giữa hai phân tử 
DNA trong quá trình phân bào 
giảm nhiễm 
v  Cơ chế cắt bỏ và chỉnh sửa 
đúng 
Cắt bỏ đoạn DNA tổng hợp 
sai và tổng hợp đoạn DNA 
mới thay thế