Bài giảng Kỹ thuật cơ bản phân tích vi sinh vật trong thực phẩm

4/18/2018
1
KỸ THUẬT CƠ BẢN
PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM
ThS. TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ
Email: vutha@case.vn
0909182242
Tháng 04/2018
ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ, PHÂN LOẠI
VI SINH VẬT
4/18/2018
2
ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT
1. Kích thước nhỏ bé
2. Sinh trưởng, phát triển nhanh
3. Thích nghi cao
4. Phân bô ́ diện rộng, đa dạng về chủng loại
VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TÍCH CỰC
CỦA VI SINH VẬT

 Tham gia quá trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên: phân giải chất hữu cơ,
khởi đầu chuỗi thức ăn, tham gia chu
trình carbon, nitơ,

 Trong công nghiệp: tham gia vào qui
trình sản xuất các hợp chất như cồn, acid
hữu cơ, enzyme,

 Trong y học: vaccin, kháng sinh, vitamin,
hormon,

 Trong chế biến, bảo quản thực phẩm: sản
xuất bột ngọt, sinh khối, rượu bia, đồ
uống lên men, bacteriocin,
4/18/2018
3
 Vi sinh vật là nguyên nhân gây ra các căn bệnh
chết người: thương hàn, dịch hạch, ung thư,
 Là tác nhân gây bệnh cho người, động/thực vật
 Làm hư hỏng lương thực/thực phẩm
VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC
CỦA VI SINH VẬT
Vi sinh vật chia làm 6 nhóm

 Virus (Vi rút)

 Bacteria (Vi khuẩn)

 Archae (Cổ khuẩn)

 Fungi (Nấm)

 Protozoa (Sinh vật nguyên sinh)

 Algae (Tảo)
PHÂN LOẠI VI SINH VẬT
4/18/2018
4
THIẾT KẾ PHÒNG THỬ NGHIỆM
VI SINH VẬT
 Không được ảnh hưởng đến độ tin
cậy của phép phân tích.
 Tránh nguy cơ tạp nhiễm chéo. Các
cách để đạt được mục tiêu đó là:
a) xây dựng phòng thử nghiệm theo
nguyên tắc “đường một chiều”
b) thực hiện phòng ngừa thích hợp để
đảm bảo phép thử và độ nguyên vẹn của
mẫu (ví dụ: sử dụng các hộp chứa được
hàn kín)
c) tách riêng các hoạt động theo thời
gian/không gian
d) Tránh các điều kiện vượt quá sự cho
phép như: nhiệt độ, bụi, độ ẩm, hơi
nước, tiếng ồn, độ rung v.v
YÊU CẦU CHUNG
4/18/2018
5
YÊU CẦU CHUNG
Để giảm nguy cơ nhiễm chéo:
a) Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa và
chịu được các chất tẩy rửa/chất khử trùng.
b) Sàn nhà không được trơn.
c) Mọi cấu trúc nổi phía trên cần được bọc kín
hoặc dễ làm vệ sinh định kỳ.
d) Các cửa ra vào và cửa sổ cần được đóng kín,
chống được bụi bám và dễ lau rửa.
e) Nhiệt độ môi trường (18°C – 27°C).
f) Môi trường phòng thử nghiệm cần được bảo
vệ chống bức xạ mặt trời ở phía ngoài.
g) Không sử dụng rèm che phía trong vì khó
làm vệ sinh và trở thành nguồn tích bụi.
YÊU CẦU CHUNG
Các khu vực phải được tách biệt:
- Nhận và bảo quản mẫu
- Chuẩn bị mẫu
- Cấy/kiểm tra mẫu
- Ủ và cấy chuyền vi sinh vật
- Bảo quản, cấy chủng chuẩn
- Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy/dụng cụ
- Bảo quản môi trường nuôi cấy và thuốc thử
- Khử nhiễm,
4/18/2018
6
KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG/KHỬ NHIỄM
1. Tiệt trùng bằng nhiệt khô
- Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, đĩa petri,
- 170 °C ± 10 °C hoặc tương đương, ít nhất 1 giờ.
2. Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm (hơi nước)
- Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, môi trường
nuôi cấy và vật liệu phòng thử nghiệm.
- Nhiệt độ 121 °C ± 3 °C, ít nhất 15 phút.
3. Tiệt trùng bằng phương pháp lọc
- Thường sử dụng cho các đối tượng không bền nhiệt
hoặc dễ mất hoạt tính khi tiếp xúc với nhiệt độ cao.
- Kích thước lỗ thường dùng 0.22, 0.45 µm
4/18/2018
7
4. Khử nhiễm bằng các hợp chất hóa học
 Sử dụng các hợp chất hóa học như các sản phẩm chứa clo,
cồn, các hợp chất amoni bậc bốn, ở nồng độ thích hợp
và để tiếp xúc với dụng cụ trong một thời gian phù hợp.
 Đảm bảo rằng dư lượng hóa chất không ảnh hưởng đến sự
phục hồi của các vi sinh vật.
5. Khử nhiễm bằng tia UV
Tia UV (tia cực tím) là sóng điện từ nằm trong phổ điện từ giữa ánh sáng nhìn
thấy và tia X. Theo ISO 21348 tia UV được chia thành ba loại như sau:
- Tia UVA (400nm÷315nm; 3.1÷3.94eV)  UV gần
- Tia UVB (280nm÷315nm; 3.94÷4.43eV)  UV trung
- Tia UVC (180nm÷280nm; 4.43÷12.4eV)  UV xa
4/18/2018
8
MỘT SỐ THIẾT BỊ VÀ
DỤNG CỤ CƠ BẢN
4/18/2018
9
TỦ AN TOÀN SINH HỌC
 Không nên sử dụng đầu đốt khí
hoặc đèn cồn trong tủ.
 Sử dụng các dụng cụ dùng một lần
(que cấy vòng, pipet, v.v...) là sự lựa
chọn thích hợp.
 Cần để các tủ càng xa các thiết bị
khác càng tốt.
 Bố trí thiết bị và vật liệu để giảm
thiểu xáo trộn luồng không khí tại
khoang làm việc.
CÂN PHÂN TÍCH
 Cân chủ yếu được sử dụng để cân mẫu thử, môi
trường nuôi cấy và thuốc thử.
 Ngoài ra, cân có thể được sử dụng để đo các thể
tích dịch pha loãng theo khối lượng.
 Độ chính xác của cân cần đạt dung sai 1% nhưng
phải đủ để đạt được dung sai tối đa 5% khối
lượng, trừ khi có quy định khác.
Ví dụ: Để cân 10g, thì cân cần có khả năng đọc đến
0,1 g.
Để cân 1g, thì cân cần có khả năng đọc đến 0,01 g.
 Đặt cân trên một mặt phẳng nằm ngang ổn định,
điều chỉnh nếu cần để đảm bảo mức thăng bằng,
chống rung và xê dịch.
4/18/2018
10
BỘ ĐỒNG HÓA/MÁY DẬP MẪU
 Được sử dụng để chuẩn bị huyền phù ban đầu từ mẫu thử nghiệm
 Không sử dụng đối với một số loại thực phẩm như:
- Có nguy cơ làm thủng túi (có mặt các hạt sắc nhọn, cứng hoặc khô)
- Các sản phẩm khó đồng hóa do cấu trúc của chúng (ví dụ: xúc xích dạng salami)
 Các máy trộn rung có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thực phẩm, bao
gồm các sản phẩm cứng/khô. Thông thường thời gian hoạt động là từ 0,5 min
đến 1 min. Nếu các vi sinh vật có thể nằm sâu bên trong cấu trúc thì cần cắt mẫu
thành từng miếng nhỏ trước khi xử lý.
 Được sử dụng để đo chênh lệch điện thế,
tại nhiệt độ xác định.
 Phải có khả năng đọc được đến 0,01 đơn
vị pH, có thể thực hiện các phép đo chính
xác đến ± 0,1 đơn vị pH.
 Máy đo pH phải có chế độ bù nhiệt thủ
công hoặc bù nhiệt tự động.
MÁY ĐO pH
4/18/2018
11
 Để khử trùng môi trường nuôi cấy,
dụng cụ thử nghiệm,...
 Không sử dụng nồi hấp áp lực để tiệt
trùng các dụng cụ sạch (hoặc các môi
trường nuôi cấy) đồng thời với dụng
cụ (hoặc môi trường nuôi cấy) đã
qua sử dụng.
 Tốt nhất là sử dụng các nồi hấp áp
lực riêng biệt cho hai quá trình này.
Sau khi hấp khử trùng, tất cả các vật
liệu và dụng cụ phải được làm nguội
trong nồi hấp, trước khi lấy ra.
 Vì lý do an toàn, không lấy sản phẩm
ra khỏi nồi hấp áp lực khi nhiệt độ
chưa giảm xuống dưới 80°C.
NỒI HẤP ÁP LỰC
TỦ ẤM
 Các tủ ấm phải điều chỉnh nhiệt độ hoặc các
thông số khác được đồng đều và ổn định.
 Nếu nhiệt độ môi trường xung quanh cao hơn
nhiệt độ của tủ, thì cần có hệ thống làm mát.
 Thành của tủ ấm cần được bảo vệ tránh ánh
nắng mặt trời.
 Không nên để đầy tủ vì tủ sẽ mất một thời gian
dài để cân bằng nhiệt độ.
 Không mở cửa tủ trong thời gian dài.
4/18/2018
12
TỦ LẠNH/TỦ ĐÔNG
Tủ lạnh
 Để tránh nhiễm chéo, bảo quản các mẫu vật
riêng rẽ ở các ngăn khác nhau:
- Môi trường chưa nuôi cấy và thuốc thử;
- Các mẫu thử nghiệm;
- Các chủng chuẩn vi sinh vật làm việc.
 Việc để sản phẩm vào tủ lạnh được bố trí sao
cho không khí lưu thông thích hợp và giảm
thiểu khả năng lây nhiễm chéo.
Tủ đông
 Tủ đông lạnh, nhiệt độ phải thấp dưới -15°C, tốt
nhất là dưới -18°C.
 Tủ đông sâu, nhiệt độ phải thấp dưới -70°C.
 Sử dụng để bảo quản các vi sinh vật, các chủng
làm việc/chủng chuẩn và các thuốc thử.
KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

 Tránh đặt kính ở nơi có độ ẩm cao có thể dẫn đến suy giảm chất lượng thấu kính.

 Lau sạch vật kính soi dầu và các bộ phận liên quan bằng khăn lau kính.
4/18/2018
13
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI SINH VẬT
4/18/2018
14
YÊU CẦU CHUNG

 Môi trường nuôi cấy được dùng cho
việc tăng sinh, phân lập, cấy chuyền và
định danh vi sinh vật.

 Phân loại môi trường theo thành phần
• Môi trường tự nhiên
• Môi trường tổng hợp
• Môi trường bán tổng hợp

 Phân loại môi trường theo công dụng
• Môi trường tiền tăng sinh
• Môi trường tăng sinh chọn lọc
• Môi trường phân lập
• Môi trường thử nghiệm sinh hóa

 Thành phần: nước, thạch, nguồn
cacbon, đạm, vi khoáng, chất ức chế
tăng trưởng, kháng sinh, chỉ thị,
ĐỐI VỚI NƯỚC

 Chỉ sử dụng nước tinh khiết hoặc nước có
chất lượng tương đương không chứa các chất
gây ức chế/ảnh hưởng đến sự phát triển của
vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm, ví
dụ: tồn dư clo, amoniac và ion kim loại.

 Nước phải được bảo quản trong vật chứa có
nắp đậy kín làm bằng vật liệu trơ (thủy tinh
trung tính, polyetylen v.v...) không chứa các
chất gây ức chế.

 Số lượng vi khuẩn không được vượt quá 103
CFU/ml và tốt nhất là dưới 102 CFU/ml. Độ
dẫn điện của nước không được lớn hơn 25
μS.cm-1 (tương đương với điện trở ≥ 0,04
MΩ.cm) và tốt nhất là dưới 5 μS.cm-1
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
4/18/2018
15
ĐỐI VỚI AGAR

 Agar (thạch) là tác nhân gây đông đặc để
tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật.

 Ưu điểm cơ bản của agar là rất nhiều loài
vi sinh vật không sử dụng làm cơ chất
dinh dưỡng.

 Nồng độ thích hợp để làm rắn môi trường
thường là 1 – 2%.

 Agar nóng chảy ở nhiệt độ 85 0C và đông
đặc ở 32 – 40 0C.
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
ĐỐI VỚI NITƠ HỮU CƠ

 Peptone
 Peptone là sản phẩm phân giải trung gian của protein, dùng làm môi trường
nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng
 Peptone trypticase là sản phẩm phân giải casein bằng pancreatin
 Phytone hay peptone papainic được trích xuất từ đậu nành
 Peptone thịt là sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin

 Cao nấm men (Yeast extract)
 Cao nấm men rất giàu các loại axit amin, vitamin,.. tạo điều kiện phát triển
tốt cho nhiều loại vi sinh vật
 Cao nấm men được điều chế bằng cách đông khô dung dịch ly trích từ nấm
men đã qua quá trình tự phân

 Cao thịt (Meat extract) 
 Được chế từ thịt đã loại bỏ gân, mỡ và xử lý sơ bộ bằng các enzym trước khi
ly trích và cô đặc. Đây là thành phần dinh dưỡng cực tốt.
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
4/18/2018
16
ĐỐI VỚI CÁC CHẤT ỨC CHẾ CHỌN LỌC
Azide và sulfite: ức chế các trực khuẩn gram âm trong môi trường
chọn lọc Streptococcii.
Chất hoạt động bề mặt (Sodium Lauryl Sulphate, Sodium Dodecyl
Sulfate): ức chế phần lớn vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh
lauryl sulfate dung tăng sinh chọn lọc và sang lọc sơ bộ Coliforms.
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Các chế phẩm từ mật bò (Ox bile)
Mật bò: làm giảm sức căng bề mặt tại vùng tiếp xúc giữa màng và môi trường, kích thích men
autolysin nội bào dẫn đến sự phân giải màng tế bào.
• Thường dùng làm môi trường chọn lọc hoặc phân lập do khả năng kích thích sự phát triển
của hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các vi khuẩn gram dương.
Hỗn hợp muối mật (Bile salts): là hỗn hợp muối Na của các acid có trong mật bò (cholic,
taurocholic, desoxycholic,) tác dụng giống như mật bò nhưng hoạt tính cao hơn và được dùng
với nồng độ thấp hơn. Trong đó desoxycholate và taurocholate là 2 hợp chất có khả năng phân
giải màng mạnh nhất.
Sodium desoxycholate: là chế phẩm muối mật được dùng nhiều trong môi trường chọn lọc hoặc
phân lập vi khuẩn đường ruột, gram âm.
4/18/2018
17
ĐỐI VỚI CƠ CHẤT PHẢN ỨNG SINH HÓA

 Những cơ chất thường dùng là các loại đường như
lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose,
arabinose, xylose, galactose, raffinose, melibiose,
glycerine, mannitol, sorbitol, adonitol,  với nồng
độ khoảng 0,5 – 1%.

 Các vi sinh vật sẽ tạo ra enzym phân giải hoặc
biến đổi những chất trong môi trường thành chất
mới, các chất mới được nhận diện bằng thuốc thử
hoặc thay đổi pH qua những chất chỉ thị màu
thích hợp.
THÀNH PHẦN
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
4/18/2018
18
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH 
CƠ BẢN VI SINH VẬT
KỸ THUẬT PHA LOÃNG
4/18/2018
19
KỸ THUẬT ĐỔ/TRÃI ĐĨA
KỸ THUẬT CẤY RIA/CẤY ĐÂM SÂU
4/18/2018
20
KỸ THUẬT LỌC MÀNG
KỸ THUẬT MPN
4/18/2018
21
4/18/2018
22
KỸ THUẬT CRYOBANK
BẢO QUẢN CHỦNG CHUẨN
Gồm các hạt sứ, xốp, rỗng tự nhiên đã được sử lý
với axit và chất lưu trữ lạnh phù hợp
(cryopreservative fluid) tạo điều kiện cho tế bào của
vi khuẩn dễ dàng bám lên bề mặt của các hạt.
4/18/2018
23
CÁCH SỬ DỤNG PIPET
4/18/2018
24
1. 
tap-huan/ky-thuat-pha-che-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vi-
khuan-c12326i14680.htm
2. ISO 7218:2007/Amd.1:2013. Microbiology of food and animal
feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations AMENDMENT 1
3. F. Power, P. Pell, and P. Sneath, 1978. A simple method for storage
of bacteria at −76°C. J. Appl. Bacteriol. 44:313-316.
4. 
Cryobank-Rekultivierungsstudie-e.pdf
5. https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colisure/
6. https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colilert/
7. Một số hình ảnh sử dụng trong tài liệu được trích dẫn từ nhiều
nguồn từ internet khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO