Sàng lọc, thu nhận và khảo sát hoạt tính lipase từ bacillus

Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011 
Trang 64 
SÀNG LỌC, THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE TỪ BACILLUS 
Trần ðăng Khoa, Lê Quang Huy, Ngô ðại Nghiệp 
Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðHQG-HCM 
(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 18 tháng 11 năm 2011) 
TÓM TẮT: Nghiên cứu với mục tiêu chọn lọc chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp lipase 
cao; từ 10 chủng Bacillus, chúng tôi chọn ñược chủng Bacillus subtilis OII (BS7) sinh lipase cao nhất ở 
pH = 7,0; nồng ñộ cơ chất 1,2% sau 3 ngày nuôi cấy. Chế phẩm lipase thu nhận ñược có pHopt 10,0; topt 
60oC. Ion Mg2+, Ca2+ là hai ion giữ hoạt tính; ion bất hoạt là Zn2+, Cu2+; SDS 0,2% làm giảm 95% hoạt 
tính lipase. Chúng tôi tinh sạch ñược lipase của BS7 có trọng lượng phân tử khoảng 23,8 kDa. Những 
kết quả trên là cơ sở cho việc tạo ra lipase tái tổ hợp từ Bacillus subtilis OII. 
Từ khóa: Bacillus, lipase, tinh sạch. 
GIỚI THIỆU 
Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm phụ enzyme 
thủy phân có serine ở trung tâm hoạt ñộng của 
tổng họ thủy phân α/β, xúc tác cho nhiều phản 
ứng khác nhau: thủy phân các liên kết 
carboxylester trong glyceride, chuyển ester 
hóa. Trong môi trường khan nước lipase có khả 
năng ester hóa rượu, ñường, thiol và amin tạo 
những ester có cấu trúc lập thể ñặc trưng [4, 
10]. Ngoài ra, lipase hiện diện rộng rãi và tham 
gia vào sự chuyển hóa sinh học của lipid trong 
tự nhiên. 
Trong những năm gần ñây, lipase giữ một vị 
trí quan trọng trên thị trường enzyme thương 
mại do khả năng xúc tác các phản ứng bề mặt 
phân cách giữa pha nước và các pha khác ở 
ñiều kiện bình thường và không tạo ra sản 
phẩm phụ. Lipase chiếm 5% thị trường enzyme 
thương mại, chỉ sau protease và carbohydratase 
[10]. Chúng ñược sử dụng trong công nghiệp 
sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, mỹ phẩm, y 
học, nhiên liệu sinh học, xử lý môi trường và 
các chế phẩm sinh học khác [8]. 
Lipase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác 
nhau như ñộng vật, thực vật hay vi sinh vật. 
Nguồn thu nhận từ vi sinh vật ñược quan tâm 
nhiều nhất do ñiều kiện sản xuất, thu nhận dễ 
dàng. Các vi sinh vật thường ñược sử dụng như 
Rhizopus, Pseudomonas, Candida, Aspergillus, 
Bacillus [4] 
Sử dụng enzyme trong các ngành công 
nghiệp, y dược,  ñang là xu hướng chung của 
cả thế giới. Ở nước ta, enzyme chủ yếu ñược 
nhập khẩu từ nước ngoài với chi phí cao, trong 
ñó lipase là một loại enzyme có giá thành cao 
và ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác 
nhau [8]. Vì vậy, việc nghiên cứu về khả năng 
sinh tổng hợp, thu nhận lipase có hoạt tính cao 
và tinh sạch từ vi sinh vật là rất cần thiết giúp 
Việt Nam có khả năng sản xuất lipase với giá 
thành rẻ, chất lượng cao mang lại hiệu quả cho 
ngân sách nhà nước. Bên cạnh ñó, vi khuẩn 
Bacillus với khả năng thích nghi cao, một số 
TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011 
 Trang 65 
loài sinh lipase có thể chịu nhiệt, chịu kiềm, 
hứa hẹn ứng dụng trong một số lĩnh vực ñòi hỏi 
ñiều kiện khó khăn, khắc nghiệt. 
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 
Vật liệu 
Chủng vi sinh vật: 10 chủng Bacillus do 
phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa – Trường 
ðH Khoa học Tự nhiên, ðHQG Tp. HCM 
cung cấp, kí hiệu: BST1, BST2, BS3, BS6, 
BS7, B1, Ba1, BL1, BL2, BL141 
Hóa chất: Dầu olive sử dụng ñể xác ñịnh 
hoạt tính lipase của hãng Fragata (Tây Ban 
Nha). 
Phương pháp 
Chọn lọc chủng có khả năng sinh lipase cao: 
Chọn nhanh chủng sinh lipase cao bằng so sánh 
vòng phân giải [3]. 
Phương pháp xác ñịnh hoạt tính lipase: Hoạt 
tính enzyme lipase ñược xác ñịnh dựa trên 
phương pháp của Nobuhiro Watanabe (1977) 
[6]. Một ñơn vị hoạt tính của lipase ñược ñịnh 
nghĩa là số µmol acid béo ñược sinh ra trong 1 
phút [6, 7]. 
Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời 
gian nuôi cấy, pH môi trường, nồng ñộ cơ chất 
ñến khả năng sinh tổng hợp lipase. 
Phương pháp khảo sát các ñặc tính của 
lipase: pH hoạt ñộng, ñộ bền, nhiệt ñộ hoạt 
ñộng, ảnh hưởng của một số ion, khả năng cắt 
ñặc hiệu. 
Phương pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký lọc 
gel Sephadex G – 75, kiểm tra ñộ tinh sạch 
bằng ñiện di SDS - PAGE [1]. 
3. KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 
Chọn lọc chủng sinh tổng hợp lipase cao 
Từ 10 chủng Bacillus, bằng phương pháp 
nuôi cấy trên ñĩa thạch với cơ chất là tributyrin 
0,1% và phương pháp ñục lỗ thạch có bổ sung 
chất phát huỳnh quang rhodamine B 0,001% 
chúng tôi chọn ñược 7 chủng có vòng phân giải 
lớn là: B1, Ba1, BL1, BL2, BST1, BST2, BS7. 
Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc sơ bộ bằng tributyrin 0,1% và rhodamine B 0,001% 
Chủng B1 Ba1 BL1 BL2 BL141 BST1 BST2 BS3 BS6 BS7 
Trybutyrin +++ ++++ ++ +++ - +++ +++ - + ++++ 
Rhodamine B + + + + - + + - + + 
Chú thích: “+” dương tính; “-“ âm tính; số lượng dấu “+” tỉ lệ với ñộ lớn vòng phân giải 
7 chủng ñược nuôi cấy lỏng trong môi trường 
cảm ứng sinh lipase. Hoạt tính lipase ñược xác 
ñịnh ñể chọn chủng có hoạt tính lipase cao 
nhất. 
Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011 
Trang 66 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
B1 Ba1 BL1 BL2 BST1 BST2 BS7
Chủng vi sinh
H
o
ạt
tín
h 
(U
I/m
l)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
pH
H
o
ạt
tín
h 
(U
I/m
l)
Hình 1. Hoạt tính lipase của 7 chủng Bacillus 
Kết quả ở Hình 1 cho thấy, chủng BS7 có 
hoạt tính lipase cao nhất là 1,8 UI/ml. Như vậy, 
chúng tôi chọn chủng BS7 – Bacillus subtilis 
OII ñể tiến hành các khảo sát tiếp theo. 
Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng BS7 
Nuôi cấy chủng BS7 trong môi trường sinh 
tổng hợp lipase. Xác ñịnh hoạt tính sau 2, 3, 4, 
5 ngày nuôi cấy. 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Thời gian nuối cấy
H
o
ạt
tín
h 
(U
I/m
l)
Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp lipase 
Qua Hình 2 nhận thấy, hoạt tính lipase tăng 
từ ngày thứ 2 cho ñến ngày thứ 3 và ñạt giá trị 
cao nhất ở 3 ngày nuôi cấy. Kết quả này tương 
tự với nghiên cứu của Senthilkumar R và cộng 
sự (2008) [11]. 
Khảo sát pH môi trường nuôi cấy chủng 
BS7 
pH môi trường là một thông số quan trọng có 
ảnh hưởng rất lớn ñến hoạt ñộng biến dưỡng 
của vi sinh vật. 
Hình 3. Ảnh hưởng pH lên khả năng sinh tổng hợp lipase 
TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011 
 Trang 67 
Từ kết quả trong Hình 3 cho thấy BS7 có khả 
năng sinh tổng hợp lipase ở pH 6,0 ñến 8,0; ở 
pH 7,0, lipase ñược tạo ra có hoạt tính cao nhất. 
Kết quả này tương tự với nghiên cứu của 
Sangeetha R và cộng sự (2008) [9]. 
Khảo sát nồng ñộ cơ chất ảnh hưởng sinh tổng hợp lipase 
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
0,8% 1,0% 1,2% 1,4% 1,6%
Nồng ñộ dầu olive (%)
H
o
ạt
tín
h 
(U
I/m
l)
Hình 4. Ảnh hưởng của nồng ñộ dầu olive lên khả năng sinh tổng hợp lipase 
Hình 4 cho thấy khả năng sinh tổng hợp 
lipase tốt nhất ở nồng ñộ dầu olive từ 1,0 – 1,2 
%. Kết quả của chúng tôi thu ñược tương tự với 
nghiên cứu của Wang và cộng sự (1995), tác 
giả sử dụng với nồng ñộ dầu olive là 1,0 % ñể 
nuôi cấy chủng Bacillus A30-1 [8]. 
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và ñộ bền chế phẩm lipase 
0
20
40
60
80
100
8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
pH
%
ho
ạt
tín
h
Hình 5. Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chế phẩm lipase (
: ñệm Tris –Cl; : ñệm carbonate) 
0
20
40
60
80
100
Trước bảo
quản
8,0 T 9,0 T 10,0 T 10,0 C 11,0 C 12,0 C
%
ho
ạt
tín
h
Hình 6. Ảnh hưởng của pH ñến ñộ bền của chế phẩm lipase (T: ñệm Tris –Cl; C: ñệm carbonate) 
Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011 
Trang 68 
0
20
40
60
80
100
30 40 50 60 70
Nhiệt ñộ ( C)
%
ho
ạt
tín
h
o 
Kết quả ở Hình 5 cho thấy chế phẩm lipase 
thu nhận từ BS7 hoạt ñộng thích hợp ở pH 10,0 
ở ñệm Tris – Cl và ñệm carbonate. Như vậy 
lipase thu nhận từ BS7 là lipase kiềm, phù hợp 
với ñặc tính lipase của Bacillus subtilis ñược 
công bố bởi Gertie van Pouderoyen và cộng sự 
(2001) [2]. 
Tương tự từ Hình 6 cho thấy chế phẩm lipase 
của BS7 giữ ñược hoạt tính cao nhất sau 24 giờ 
bảo quản trong dung dịch ñệm pH 10,0 ở 4oC. 
ðệm Tris – Cl ở pH 10,0 và ñệm carbonate ở 
pH 10,0 giữ ñược hoạt tính gần như nhau. 
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt 
tính của chế phẩm lipase 
Nhiệt ñộ cũng là một thông số quan trọng 
ảnh hưởng ñến vận tốc phản ứng của enzyme. 
Khi nhiệt ñộ tăng lên sẽ dẫn ñến vận tốc phản 
ứng enzyme tăng, nhưng ñến một mức nào ñó 
nhiệt ñộ tăng sẽ ức chế hoạt ñộng của enzyme 
và có thể bất hoạt enzyme. 
Hình 7. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính chế phẩm lipase 
Qua Hình 7 cho thấy chế phẩm lipase của 
BS7 có thể hoạt ñộng ở nhiệt ñộ 50 – 60 oC, topt 
là 60 oC. Kết quả tương tự với kết quả của 
Wang và cộng sự (1995) khi nghiên cứu lipase 
của chủng Bacillus sp. A 30 – 1 có topt là 60 oC 
[8]. 
Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim 
loại và chất tẩy rửa ñến hoạt tính của chế 
phẩm lipase 
Lipase ñược ứng dụng nhiều trong ngành 
công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy nên khả 
năng giữ ñược hoạt tính khi có mặt các ion và 
chất tẩy rửa trong hỗn hợp rất quan trong. Tùy 
vào nồng ñộ và loại ion, chất tẩy khác nhau mà 
sẽ làm tăng, giữ tốt hoạt tính hay giảm. 
TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011 
 Trang 69 
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930
Thứ tự các phân ñoạn
O
D
28
0 
n
m
0
20
40
60
80
100
Mẫu
chứng
Ca2+
1mM
Mg2+
1mM
Zn2+
1mM
Cu2+
1mM
SDS 0,2% Omo 0,2%
%
ho
ạt
tín
h
Hình 8. Ảnh hưởng của ion và chất tẩy rửa lên hoạt tính chế phẩm lipase 
Sau khi ủ 1 giờ ở 4oC với các tác nhân trên, 
chế phẩm lipase từ chủng BS7 bị kìm hãm ñối 
với ion Zn2+ và Cu2+. Các ion Ca2+ và Mg2+ hầu 
như không ảnh hưởng ñến hoạt tính, ion Mg2+ 
giữ ñược hoạt tính tốt nhất. Dung dịch SDS 
0,2% làm giảm gần 95% hoạt tính, bột giặt 
Omo 0,2% làm hoạt tính giảm 76,57%. 
Khả năng cắt ñặc hiệu của chế phẩm 
lipase thu nhận từ BS7 
Sau khi thực hiện phản ứng chuyển ester hóa, 
chúng tôi tiến hành sắc ký khí GC – MS, kết 
quả hàm lượng alkyl ester của acid béo là 4,948 
%; 2-monoglyceride là 24,561%, không phát 
hiện 1-monoglyceride và diglyceride; các chất 
khác là 66,408 % (triglyceride, dẫn xuất 
cholesterol, các ester khác). Từ kết quả thu 
ñược, có thể kết luận chế phẩm lipase thu nhận 
từ BS7 có vị trí cắt ñặc hiệu là 1 và 3 trên phân 
tử triglyceride, ñiều này phù hợp với nghiên 
cứu của Gertie van Pouderoyen và cộng sự 
(2001) [2]. 
Tinh sạch lipase bằng phương pháp lọc gel 
Sephadex G-75 
Kết quả ño OD280 ñược ghi nhận ở Hình 9. 
Hình 9. Sắc ký ñồ biểu diễn các phân ñoạn lọc gel Sephadex G - 75 
Sau lọc gel Sephadex chúng tôi thu ñược 3 
peak: peak 1 không có hoạt tính; peak 2 có hoạt 
tính riêng 1,07 UI/mg Pr; peak 3 có hoạt tính 
riêng cao nhất ñạt 35,57 UI/mg Pr. Hiệu suất 
thu nhận protein sau khi lọc gel là 88,53%; 
tổng hoạt tính lipase thu lại sau khi lọc gel ñạt 
48,54%. Hoạt tính riêng lipase của peak 3 cao 
Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011 
Trang 70 
∼ 45 kDa 
∼ 23,8 kDa 
hơn hoạt tính riêng lipase trước khi lọc gel gần 
6 lần. 
Kiểm tra ñộ tinh sạch của enzyme sau khi 
lọc gel bằng ñiện di SDS – PAGE 
Chúng tôi tiến hành tủa protein ở peak 3, ly 
tâm thu lấy tủa, rửa tủa, hòa lại trong nước cất 
hai lần rồi tiến hành chạy ñiện di SDS – PAGE. 
Kết quả ñiện di ñược trình bày ở Hình 10, nhận 
thấy rằng: 
Ở giếng 2 có 2 vạch ñậm và 1 số vạch mờ. 
Vậy mẫu chế phẩm lipase trước khi lọc gel 
Sephadex G-75 có nhiều loại protein. Giếng 3 
có 1 vạch, protein có trọng lượng phân tử 
khoảng 23,8 kDa. 
Vậy chúng tôi ñã tinh sạch ñược enzyme 
lipase thu nhận từ chủng Bacillus subtilis OII 
có trọng lượng phân tử khoảng 23,8 kDa. Kết 
quả này tương tự với nghiên cứu của Jisheng 
Ma và cộng sự (2006) ñã tinh sạch ñược lipase 
từ chủng Bacillus subtilis IFFI10210 với trọng 
lượng phân tử là 24 kDa [5]. 
Hình 10. Kết quả chạy diện di SDS – PAGE 
Giếng 1: thang chuẩn protein 
Giếng 2: chế phẩm lipase trước khi tinh sạch 
Giếng 3: protein ở peak 3 
KẾT LUẬN 
Chúng tôi ñã chọn lọc ñược chủng BS7 
(Bacillus subtilis OII) có khả năng sinh tổng 
hợp lipase cao trong các chủng khảo sát (4,86 
UI/ml). ðiều kiện cho BS7 tổng hợp nhiều 
lipase là pH 7,0; 1,2% dầu olive nhũ hóa; sau 3 
ngày nuôi cấy. Chế phẩm lipase thu nhận từ 
BS7 có khả năng chịu kiềm (pHopt 10,0), chịu 
nhiệt (topt 60oC), có vị trí cắt 1 và 3 trên phân tử 
triglyceride. Trọng lượng phân tử lipase thu 
nhận ñược khoảng 23,8 kDa. 
TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011 
 Trang 71 
SELECTION, PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF BACILLUS LIPASE 
Tran Dang Khoa, Le Quang Huy, Ngo Dai Nghiep 
University of Science, VNU-HCM 
ABSTRACT: The objective of this study is to screen Bacillus strains for high lipase 
production; from 10 strains of Bacillus subtilis OII (BS7) has ability the best lipase production. The 
maximum lipase was carried out using liquid culture medium at pH 7,0, substrate concentrations 1,2% 
(w/w) after 3 days. The optimum pH and temperature on lipase activity were found to be pH 10,0 and 
60 oC respectively. Ion Mn2+, Ca2+ are the ions remain activity; active lipase was inhibited by Cu2+, 
Zn2; solution of SDS 0,2 % decreases 95% activity. Molecular weight of lipase production by BS7 is 
approximate 23,8kDa. The results are preconditions for the research on recombinant lipase by Bacillus 
subtilis OII. 
Key words: Bacillus, lipase, purification. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, 
NXB ðHQG TP.HCM (2003). 
[2]. Gertie V P, Thorsten E, Karl-Erich J and 
Bauke W D, The Crystal Structure of 
Bacillus subtilis Lipase: A Minimal a/b 
Hydrolase Fold Enzyme, J. Mol. Biol, 
309: 215 – 226 (2001). 
[3]. Gisela K and Karl-Erich J, Specific and 
Sensitive Plate Assay for Bacterial 
Lipases, Applied and Environmental 
Microbiology: 211 – 213 (1987). 
[4]. Hansan F, Ali S A, Hameed A, Industrial 
application of microbial lipases, Enzyme 
and Microbial Technology, 39 (2): 235 – 
251 (2006). 
[5]. Jisheng M, Zuoming Z, Baijing W, 
Xiangju K, Yuguo W, Shugui C, Yan F, 
Overexpression and characterization of a 
lipase from Bacillus subtilis, Protein 
Expression and Purification, 45: 22 – 29 
(2006). 
[6]. Nobuhiro W, Yasuhide O, Yasuji M and 
Koichi Y, Isolation and Identification of 
Alkaline Lipase Producing 
Microorganisms, Cultural Conditions 
and Some Properties of Crude Enzymes, 
Agricutural and Biological Chemistry, 
41 (8): 1353 – 1538 (1977). 
[7]. Praphan P and Kirk L P, Lipase Assays – 
Food Analytical Chemical, C3.1.1 – 
C3.1.13 (2001). 
[8]. Rohit S, Yusuf C, Uttam C B, 
Production, purification, 
characterization, and applications of 
lipases, Biotechnology Advances, 19: 
627–662 (2001). 
[9]. Sangeetha R, Geetha A and Arulpandi I, 
Optimization of protease and lipase 
production by Bacillus pumilus SG 2 
Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011 
Trang 72 
isolated from an industrial effluent, The 
Internet Journal of Microbiology, 
Volume 5, Number 2 (2008). 
[10]. Saxena R K, Ghosh P K, Rani G, Sheba 
D W, Sapna B and Ruchi G, Microbial 
lipase: Potential biocatalysts for the 
future industry, Current Science, 77(1): 
101 – 115 (1999). 
[11]. Senthilkumar R and Selvakumar G, 
Isolation and Characterization of an 
Entracellular Lipase Producing Bacillus 
sp. SS-1 from Slaughterhouse Soil, 
Advanced Biotech, 24 – 25 (2008).