Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ natto Nhật Bản làm giống sản xuất natto

Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 38 
PHAÂN LAÄP VI KHUAÅN BACILLUS SUBTILIS TÖØ NATTO 
NHAÄT BAÛN LAØM GIOÁNG SAÛN XUAÁT NATTO 
Buøi Thò Nhung
(1)
, Nguyeãn Höõu Phuùc
(2) 
 (1) Trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, (2) Viện Sinh học Nhiệt đới 
TÓM TẮT 
Bài báo trình bày kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto Nhật Bản, kết 
quả chọn lọc khả năng sinh protease của từng chủng và chọn lọc được hai chủng, đồng 
thời định danh chúng thuộc loài Bacillus subtilis. Hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis. 
N441 đã được sử dụng sản xuất Natto, chủng B.subtilis N18 thích hợp để sản xuất chế 
phẩm enzym giàu Nattokinase còn chủng B.subtilis N441 thích hợp để sản xuất natto. 
Từ khóa: phân lập, vi khuẩn, định danh 
* 
1. Mở đầu 
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 
hàng năm có khoảng 17 triệu người chết do 
các bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim, và đột 
quy), mà nguyên nhân là hậu quả của chứng 
huyết khối. Theo ước tính thị trường toàn cầu 
về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỷ 
USD (Cong et al., 2009). Các loại thuốc làm 
tan huyết khối như Alteplase (t-PA), 
Streptokinase, Urokinase (UK), Tenec-
teplase có hiệu lực tức thì sau khi tiêm tĩnh 
mạch. Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học 
của các loại thuốc này tồn tại không lâu sau 
khi tiêm, giá đắt, đồng thời cũng có nguy cơ 
biến chứng gây xuất huyết (Thomas et al., 
1996). Nattokinase là enzyme có trong sản 
phẩm natto của Nhật Bản. Nattokinase là 
protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid 
(trọng lượng phân tử 27,727Da) đã được 
Hyroyuki Sumi phát hiện về khả năng làm 
tan huyết khối năm 1980 (Sumi et al., 1987). 
Do có nguồn gốc thực phẩm, nên dễ được 
chấp nhận về mặt y tế, và người tiêu dùng sử 
dụng các chế phẩm Nattokinase như một 
thực phẩm chức năng để phòng bệnh huyết 
khối. Hoạt tính làm tan huyết khối của 
nattokinase tương đối mạnh, và kéo dài, 
giảm chứng cao huyết áp (Kimet at el al., 
2011), phân giải protein dạng amyloid liên 
quan đến bệnh Alzhemer, bệnh bò điên 
(Ruii- Lin Hsu, 2009), tăng cường hoạt hóa 
plasminogen và làm bất hoạt plasminogen 
activator inhibitor (Sumi et al,1987, Urano 
et al. 2001). Nhiều tác giả trên thế giới và 
trong nước đã phân lập các chủng vi khuẩn 
Bacillus subtilis từ Natto hoặc các thực 
phẩm lên men để nghiên cứu sản xuất 
nattokinase (Chang et al., 2004, Cong et al., 
2009, Deepak et al., 2008, Egwin et al., 
2012, Lê Thị Bích Phương et al., 2012). 
Nghiên cứu này nhằm mục đích phân 
lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ natto Nhật 
Bản để sản xuất natto. 
2. Phương pháp nghiên cứu 
• Nguyên liệu 
Natto Nhật Bản mua tại Tokyo shop 
15A8 Lê Thánh Tôn, Quận 1, thành phố Hồ 
Chí Minh. Đậu nành mua ở siêu thị 
Co.opmart, do công ty TNHH thương mại 
dịch vụ Xuân Hồng cung cấp. 
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
39 
• Phương pháp nghiên cứu 
Phương pháp làm natto với đậu nành: 
Đậu nành ngâm qua đêm. Cho vào hấp vô 
trùng ở 1 kg/cm2 trong 1 giờ để đậu chín 
nhừ, không xát vỏ, để nguyên hạt. Đậu đã 
chín để nguội. Cấy giống B.subtilis N18 
hoặc B.subtilis N441 vào đậu nành hấp 
chín để nguội, sau đó bỏ vào hộp 
polypropylen, mỗi hộp khoảng 40 - 50 
gram đậu nành. Phủ hộp bằng vải màn. Ủ ở 
40
0
C. Sau 20 - 24h thu được sản phẩm 
natto, đánh giá kết quả. 
• Phương pháp làm natto bằng đậu 
nành và cơm gạo lức: Gạo lức, ngâm qua 
đêm, sáng mai cho vào nồi cơm điện nấu 
chín. Trộn đều cơm gạo lức và hạt đậu 
nành đã hấp chín với tỉ lệ 5 đậu nành/ 4 gạo 
lức. Cấy giống, ủ tương tự như tiến trình 
đối với cách làm natto đậu nành. Đánh giá 
chất lượng cảm quan và hoạt tính protease 
của từng nghiệm thức. Xác định hoạt tính 
protease theo phương pháp Anson cải tiến. 
3. Kết quả và thảo luận 
• Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto 
của Nhật Bản 
Natto là thực phẩm lên men truyền 
thống của Nhật Bản được cho là có lịch sử 
trên 1.000 năm. Natto được sản xuất trên 
nguyên liệu đậu nành với vi khuẩn Bacillus 
subtilis natto. Hiện nay hàng năm Nhật Bản 
sản xuất trên 300.000 tấn. Natto làm giảm 
đông máu, nhờ phân giải fibrin của huyết 
khối và ức chế hoạt hóa plasminogen giúp 
phòng tránh chứng huyết khối. Qua bốn đợt 
phân lập cho thấy vi khuẩn Bacillus trong 
Natto của Nhật Bản có mật độ cao, từ 1-2 x 
10
9
 cfu trong một gam sản phẩm tươi, hình 
thái khuẩn lạc khá đồng đều, là những 
khuẩn lạc Bacillus điển hình. Sau khi phân 
lập, làm thuần, chúng tôi đã chọn lựa được 
20 cá thể. Các cá thể phân lập được đều 
phát triển tốt hơn trên môi trường có nước 
chiết đậu nành hoặc sữa đậu nành so với 
môi trường peptone-glucose. 
Hình 1. Hình thái khuẩn lạc Bacillus trong 
Natto Nhật Bản 
Hình 2. Hình thái khuẩn lạc các vi khuẩn phân 
lập từ Natto Nhật Bản 
• Tuyển chọn các vi khuẩn Bacillus sp. 
có hoạt tính protease cao 
Để đánh giá khả năng cho hoạt tính 
protease của từng cá thể phân lập được, 
chúng tôi đã thử nghiệm trên môi trường 
lên men bán rắn, sau từng thời gian lên men 
24h, 48h và 72h, chiết protease của từng 
môi trường nuôi cấy với từng chủng khác 
nhau khác nhau. Xác định hoạt tính 
Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 40 
protease theo phương pháp Anson cải tiến. 
Kết quả trình bày ở hình 3. 
Hình 3. Hoạt tính protease của 10 mẫu vi 
khuẩn đã tuyển chọn 
Kết quả được trình bày ở hình 3 cho 
thấy đa số các chủng nghiên cứu sinh 
tổng hợp protease cao nhất sau 48 giờ 
nuôi cấy với hoạt tính cực đại là 110,53 
U/g (ở chủng N18). Tùy theo hình thức 
lên men dịch thể hay lên men bán rắn mà 
thời điểm đạt được hoạt tính enzyme cao 
nhất sẽ khác nhau. Dong Mingsheng et 
al., (2001) cho rằng chủng Bacillus 
subtilis khi lên men dịch thể cho hoạt tính 
cao nhất sau 24 giờ. Chang Jin Liu et al., 
(2004) đã nghiên cứu sinh tổng hợp 
Nattokinase của chủng Bacillus subtilis 
SBS (J) đạt tối ưu tại 44 giờ. 
3. Định danh hai chủng vi khuẩn 
N18 và N441 
3.1. Đặc điểm hình thái 
Để nghiên cứu đặc điểm sinh học và 
định danh 2 mẫu N18 và N441, chúng tôi 
tiến hành cấy trên môi trường thạch đĩa ở 
37
o
. Sau 24 giờ, quan sát hình dạng, màu 
sắc, bề mặt khuẩn lạc, làm tiêu bản, nhuộm 
Gram và nhuộm bào tử. Kết quả được nêu 
trong bảng 1. 
Đặc điểm Đặc điểm hình thái mẫu N18 Đặc điểm hình thái mẫu N441 
Hình thái khuẩn 
lạc 
Bề mặt hơi nhăn, khô, màu hơi vàng, 
ở giữa có một núm nhỏ hình tròn có 
màu vàng nhạt hơn, mép hình răng 
cưa, lan trên bờ mặt thạch 
Bề mặt nhăn, nhầy và có các gợn sóng, 
màu trắng đục, mép hơi nhăn và bám chặt 
vào bề mặt thạch 
Hình thái TB Hình que, ngắn, nhỏ, xếp đơn hoặc 
đôi, bắt màu tím chứng tỏ chủng này 
là VKG(+) 
Hình que, mảnh, xếp đơn hoặc đôi, bắt màu 
tím chứng tỏ chủng này là VKG(+) 
Hình thành nội 
bao tử 
Hình thành nội bào tử, phân bố chính 
tâm 
Hình thành nội bao tử, phân bố chính tâm 
Bảng 1. Đặc điểm hình thái của hai chủng N18 và N441 
Hình dạng tế bào và bào tử đã được xử 
lý bằng cách cố định tế bào bằng 0,25% 
glutaraldehyde trong dung dịch đệm 
phosphate pH=7,2 và khử nước bằng 
ethanol ở các nồng độ đậm dặc tăng dần từ 
30% đến 100%. Mẫu vi khuẩn chụp bằng 
kính hiển vi điện tử quét do Viện công 
nghệ Hóa, Viện hàn lâm khoa học Việt 
Nam thực hiện. Tế bào hình que ngắn điển 
hình của B.subtilis, bào tử thấy rõ phần 
trung tâm, còn các phần vỏ bị biến đổi 
a) Bào tử B.subtilis N18 
0
20
40
60
80
100
120
N
24
N
17 B
C
N
21
N
32 8.
1
N
23
N
18
N
44
1
N
36
H
o
ạ
t 
tí
n
h
 p
ro
te
a
s
e
 (
U
/g
)
24h 40h 48h 72h
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
41 
b) Tế bào B.subtilis N18 
Hình 4. Tế bào và bào tử B.subtilis N18 chụp 
trên kính hiển vi điện tử quet (SEM) 
3.2. Định danh hai chủng vi khuẩn 
N18 và N441 bằng sinh học phân tử 
Chúng tôi gửi hai mẫu N18 và N441 đến 
công ty xét nghiệm Nam Khoa để định danh 
bằng cách giải trình tự gen 16S-rARN và so 
sánh với ngân hàng gen. Kết quả, trình tự gen 
16S rRNA của hai chủng như sau: 
• Chủng N441: 
ATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGC
GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC
AGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGC
GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTA
ACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCG
GGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTG
TTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAG
GTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGA
CCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGG
TAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTA
GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG
CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATC
GTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA
GTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGA
CGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAA
CTACGTGC 
• Chủng N18: 
TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGC
CTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAT
GGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCG
GACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG
CCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA
CCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGA
ACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGC
TTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCG
GCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGAC
CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG
GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGA
CGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG
AGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC
TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTT
CGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCT
AACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG 
So sánh với trình tự 16S-rARN của loài 
vi khuẩn đã được định danh trong ngân 
hàng gen BLAST SEARCH. Kết quả cho 
thấy mức độ giống nhau của hai mẫu N18 
và N441 với loài B. subtilis là 100%. Kết 
này có thể kết luận mẫu N18 và N441 đã 
phân lập được là B. Subtilis. 
3.3. Sản xuất natto bằng đậu nành 
hấp chín với hai chủng B.subtilis N18 và 
B.subtilis N441 
Từ hai chủng B.subtilis N18 và B. 
subtilis N441 đã phân lập được, chúng tôi 
tiến hành làm Natto, với các nghiệm thức 
khác nhau. Kết quả xác định hoạt tính 
protease của các nghiệm thức trình bày ở 
bảng 2. 
Chủng 
Hoạt độ protease 
(U/g ướt) 
N18, ĐN 57,952 
N18, ĐN -GL 50,979 
N441, ĐN 49,534 
N441, ĐN + GL 42,561 
Journal of Thu Dau Mot University, No 1 (14) – 2014 
 42 
N18 & N441, ĐN 55,604 
N18 & N441, ĐN + GL 49,317 
Natto của Nhật Bản 58,169 
Bảng 2 
Kết quả thử nghiệm lên men đậu nành 
hạt hấp chín làm Natto cho thấy cả hai chủng 
B.subtilis N18 và B. subtilis N441 đều có khả 
năng sử dụng làm Natto. Hoạt lực protease 
trong các sản phẩm Natto làm ra đều tương 
đương với hoạt lực protease trong Natto của 
Nhật bản. Đánh giá cảm quan chấp nhận tốt. 
Do Natto sản xuất bằng chủng B.subtilis N18 
có hoạt tính protease cao hơn, nhưng độ nhớt 
thấp so với Natto sản xuất với chủng B. 
subtilis N441, vì vậy chủng B. subtilis N18 
thích hợp để sản xuất protease (Nattokinase) 
còn chủng B. subtilis N441 thích hợp để sản 
xuất Natto. Kết quả thí nghiệm cũng thấy 
rằng khi kết hợp thêm gạo lức hoạt tính 
enzyme giảm so vơi nghiệm thức chỉ một 
mình đậu nành hấp chín. Ở nghiệm thức đậu 
nành hấp chín cùng với cơm gạo lức hoạt lực 
enzyme thấp hơn so với nghiệm thức chỉ 
mình đậu nành hấp chín, nhưng khi ăn ở 
nghiệm thức có gạo lức dễ ăn hơn, thích hợp 
cho một số dối tượng. Mùi vị của Natto 
không hấp dẫn nhiều người (20% người Nhật 
không thích mùi natto), cũng như nước mắm, 
mắm tôm, chao đối với nhiều người trong 
chúng ta, tất cả do thói quen, natto là một 
món ăn rất tốt cho sức khỏe do enzyme 
Nattokinase trong Natto có hoạt tính mạnh 
gấp bốn lần plasmin nội sinh, có khả năng 
làm tan cục máu đông và giảm huyết áp. 
Natto sẽ là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng 
cao và phòng chống các bệnh tim mạch tốt 
đối với người Việt Nam, nếu được sản xuất 
trong nước với giá bán phải chăng. 
4. Kết luận 
Natto Nhật Bản bán tại Việt Nam có mật 
độ tế bào cao, khá thuần khiết, có thể sử dụng 
trực tiếp để làm giống sản xuất Natto tại gia 
đình, hoặc sử dụng trực tiếp sẽ cung cấp 
Nattokinase có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe. 
Mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis cao trong 
Natto có tác dụng probiotic tốt cho hệ đường 
ruột. Hai chủng B.subtilis N18 và B. subtilis 
N441 đã được chọn lọc có khả năng sử dụng 
để sản xuất Natto hoặc sản xuất chế phẩm 
enzyme giàu Nattokinase, một loại thực 
phẩm chức năng giúp đề phòng chứng huyết 
khối nguy hiểm. 
ISOLATING BACILLUS SUBTILIS BACTERIA FROM JAPANESE NATTO TO 
MAKE BREED FOR NATTO PRODUCTION 
Bui Thi Nhung
(1)
, Nguyen Huu Phuc
(2) 
(1) Ho Chi Minh City University of Pedagogy (2) Institute of Tropical Biology 
ABSTRACT 
 This paper presents the results of isolation of bacillus bacterial strains from Japanese 
Natto. The results selected protease fertility of each strain. Two strains were selected and 
identified them as Bacillus subtilis species. The two strains of B. subtilis N18 and B. 
subtilis. N441 have been used to produce Natto. B.subtilis N18 strain was suitable for the 
production of rich nattokinase enzyme preparations and B.subtilis N441 was suitable for 
the production of Natto. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Lê Thị Bích Phương, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị 
Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012), Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh 
tổng hợp nattokinase, Tạp chí Sinh học 34(3SE), 99-104. 
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 1 (14) – 2014 
43 
[1] Cong Wang, Ming Du, Dongmei Zheng, Fandong Kong, Guoren Zu, Yibing Feng 
(2009), Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto 
B12, J.Agric.Food Chem 57, 9722-9729. 
[2] Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char T., and Pusp P. (2011), Isolation, profuction, 
purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (nattokinase, 
streptokinase,and Urokinase) from bacterial sources, Americam journal of 
Biotechnology 10(8), 1408-1420. 
[3] Ruei-Lin Hsu , Kung-Ta lee, jung-Hao Wang, Lily Y-.L. Lee, and Ria P.-y. Chen 
(2009), Amyloid degradatingability of nattokinase from Bacillus subtilis Natto, J. Agric 
Food Chem 57, 503- 508. 
[4] Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Muraki H. (1987), A novel fibrinolytic enzyme 
(nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the 
Japanese diet, Experienta, 43, 1110-1111. 
[5] Sumi H, Yoshikawa M, Baba T, Kubota H (1999), Elastase activity and Nattokinase in 
Natto, Agricultural Chemistry, 73, 1187-1190. 
[6] Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H. (1990), Enhancement of the 
Fibrinolytic Activity in Plasma by Oral Administration of Nattokinase, Acta Haematol, 
84, 139-143. 
[7] Sumi H., H. Hamada*, H. Tsushima, H. Mihara and H. Muraki*, A novel fibrinolytic 
enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food 
in the Japanese diet Experientia, Department of Physiology, Miyazaki Medical College, 
Miyazaki 889-16 (Japan), 1987, Oct 15; 43(10):1110-1. 
[8] Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, Yingnan Yang, Haittao Che, Guihua zhang Ji Li (2010), 
Thrombolytic activities of nattokinase extracyed from Bacillus subtilis fermented 
soybean cird residues, International Journal of Biology 2(2), 120-125. 
[9] Yeon Kyoung Kim, Sang Mi Kim, Ji Yeon Kim, and Oran Kwon (2011), The culture 
filtrates from Bacillus subtilis natto lowers blood pressure via rennin – angiotensin 
system in spontaneously hypertensive rats fed with a high cholesterol diet, J. Korean 
Soc appl Biol. Chem 54(6), 959-965.