Nghiên cứu tạo chế phẩm horse radish peroxydaseprogesterone tự gắn dùng trong bộ kit Eia-P4 và ứng dụng để chẩn đoán có thai sớm ở bõ

Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
65 
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM HORSE RADISH PEROXYDASE-
PROGESTERONE TỰ GẮN DÙNG TRONG BỘ KIT EIA-P4 
VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN CÓ THAI SỚM Ở BÕ 
 Nguyễn Mạnh Hà1*, Phan Văn Kiểm2 
1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên, 2Viện Chăn nuôi Việt Nam 
TÓM TẮT 
Đề tài nghiên cứu tạo chế phẩm Horse Radish Peroxydase-progesterone (HRP) sử dụng cho phản 
ứng ELISA để định lƣợng hàm lƣợng progesterone (P4). Kết quả sau 2 lần gắn đã thu đƣợc 2,05 ml 
phức hợp HRP-P4 đậm đặc (HRP-P4 tự gắn). Sau khi xác định đƣợc đƣờng cong chuẩn, đề tài đã 
xác định đƣợc tỷ lệ pha loãng thích hợp đối với HRP-P4 tự gắn sử dụng cho phản ứng ELISA là 
1/500000. 
Sử dụng HRP-P4 tự gắn cho phản ứng ELISA định lƣợng hàm lƣợng P4 đối với 29 bò cái lai sinh 
sản F2, F3 để chẩn đoán có thai sớm cho kết quả chính xác. 16 bò có hàm lƣợng P4 từ 0,25-
0,28ng/ml ở ngày động dục (ngày 0) sau đó tăng nhanh đạt 0,88 mg/ml ở ngày thứ 7, đạt 1,83 ng/ml 
ở ngày thứ 21 và đạt 2,41 ng/ml ở ngày 25 sau phối giống đƣợc chẩn đoán đã có thai. 
Sử dụng HRP-P4 tự gắn có thể thay thế cho HRP-P4 nhập ngoại trong bộ Kit EIA-P4 trong phản 
ứng ELISA để định lƣợng hàm lƣợng P4 phục vụ chẩn đoán có thai sớm ở bò. 
Từ khóa: Horse Radish Peroxydase-Progesterone, chẩn đoán có thai sớm ở bò 
ĐẶT VẤN ĐỀ* 
Động thái của hormone progesterone (P4) có 
trong huyết thanh (hoặc trong sữa) là tín hiệu 
quan trọng phản ánh tình trạng hoạt động của 
buồng trứng, tình trạng mang thai của con vật 
cũng nhƣ tín hiệu trong một số bệnh sinh sản. 
Việc xác định hàm lƣợng hormone P4 trong 
huyết thanh (hoặc sữa) có thể nhanh chóng 
giúp chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh cũng 
nhƣ có thai sớm với thời gian nhanh, chính 
xác, hạn chế những tác động không có lợi từ 
khám thai trực tiếp qua trực tràng đối với cơ 
thể con mẹ và bào thai. 
Để thực hiện phản ứng ELISSA định lƣợng 
hàm lƣợng P4 cần phải có Kit Enzyme 
Immuno Assay-Progesterone (EIA-P4) với 
các thành phần chính là: Kháng thể kháng P4 
và HRP-P4. Hiện tại Kit này phải nhập ngoại, 
giá thành rất đắt. Mỗi lần nhập, thƣờng phải 
vẽ lại đƣờng cong chuẩn trong định lƣợng vì 
Kit không cùng một lô sản xuất. 
Để chủ động nguyên liệu sử dụng trong phản 
ứng ELISA, đồng thời giảm giá thành sản 
xuất, đề tài tiến hành nghiên cứu tạo chế 
*
 Tel: 0912 004814 
phẩm HRP-P4 sử dụng trong Kit EIA-P4 để 
xác định hàm lƣợng P4 ở gia súc cái ứng 
dụng để chẩn đoán có thai sớm. 
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG 
PHÁP NGHIÊN CỨU 
Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu 
Đối tượng nghiên cứu 
Bò cái lai F2, F3 đã đẻ 1-2 lứa, khối lƣợng cơ 
thể 400-500kg/con, sinh sản bình thƣờng, số 
lƣợng 29 con 
Vật liệu nghiên cứu 
- Thiết bị thí nghiệm, dụng cụ thí nghiệm, hóa 
chất dùng cho phản ứng ELISA của phòng thí 
nghiệm Bộ môn sinh sản và thụ tinh nhân tạo, 
Viện Chăn nuôi 
- Bộ kít chuẩn 
Kháng kháng thể: là kháng thể để kháng lại 
IgG của thỏ 
Kháng thể P4 
P4 gắn enzyne: HRP-P4 (Horse Radish 
Peroxydase –Progesterone) 
Địa điểm tiến hành 
Đề tài đƣợc tiến hành tại Bộ môn sinh sản và 
thụ tinh nhân tạo- Viện Chăn nuôi Quốc gia 
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
66 
Nội dung nghiên cứu 
- Nghiên cứu tạo chế phẩm Horse Radish 
Peroxydase-Progesterone (HRP-P4) dùng 
trong Kit chẩn đoán EIA-P4 
+Nghiên cứu phƣơng pháp gắn HRP-P4 
+ Xác định độ pha loãng thích hợp của HRP-
P4 tự gắn để dùng trong phản ứng ELISA 
- Nghiên cứu ứng dụng để kiểm tra động dục, 
phối giống và chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa 
sau 21 ngày phối giống 
Phƣơng pháp nghiên cứu 
Phương pháp gắn P4 với HRP 
- Phƣơng pháp thử độ pha loãng thích hợp 
của HRP-P4 tự gắn theo phƣơng pháp của 
ISobe. N, Nakao. T (2002) [2] 
- Phƣơng pháp định lƣợng ELISA-P4 theo 
phƣơng pháp của ISobe. N, Nakao.T (2002) [3] 
Phương pháp lấy mẫu sữa 
Lấy mẫu sữa của bò vào các ngày: ngày động 
dục (ngày 0), ngày 7, ngày 14, ngày 21 và 
ngày thứ 25 sau phối giống. 
Mẫu sữa: cho khoảng 15mg K2Cr2O7 vào ống 
nghiệm, lấy khoảng 7-10ml sữa, trộn đều, giữ 
ở 40C rồi chuyển về phòng thí nghiệm. 
Phương pháp xử lý mẫu 
Sau khi đƣa về phòng thí nghiệm, mẫu đƣợc 
đƣa vào máy ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 
15 phút sau đó tách lấy huyết tƣơng. Mẫu sau 
khi xử lý xong đƣợc đƣa vào tủ lạnh sâu bảo 
quản ở -200C cho đến khi phân tích. 
Định lượng Progesterone bằng kỹ thuật 
ELISA 
Phản ứng EIA-P4 đƣợc thực hiện trên đĩa 
nhựa chứa 8x12 giếng = 96 giếng. Kích thƣớc 
mỗi giếng: cao 1cm, đƣờng kính 0,7cm. Phản 
ứng thực hiện qua 3 bƣớc: Gắn kháng thể vào 
các giếng (coat đĩa), thực hiện phản ứng kết 
hợp đặc hiệu: kháng kháng thể- kháng thể- 
kháng nguyên theo cơ chế cạnh tranh và thực 
hiện phản ứng enzyme cơ chất. 
Phương pháp xác định đường cong chuẩn 
Xác định đƣờng cong chuẩn theo phƣơng 
pháp của Isobe và Nakao.T (2002)[] 
Phương pháp xử lý số liệu 
- Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Excel 
- Nồng độ progesteron đƣợc đánh giá theo 
đơn vị quốc tế ng/ml, theo chƣơng trình phần 
mềm đã đƣợc cài đặt sẵn trong máy tính. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Kết quả gắn HRP-P4 
Tạo dung dịch 1 
Hòa tan P4 với nồng độ 0,024 mmol, NHS 
nồng độ 0,043mmol và DCC nồng độ 
0,024mmol trong DMF. Trộn đều hỗn hợp 
trong vòng 2 giờ đến khi xuất hiện kết tủa 
(dicyclohexylurea). Sản phẩm đƣợc đƣa vào 
ly tâm ở 2800 vòng/phút trong 20 phút. 
Huyễn dịch thu đƣợc là hỗn hợp ester hoạt 
hóa với P4 (progesterone-ester). Lọc bỏ kết 
tủa, lấy phần dung dịch hòa tan. 
Tạo dung dịch 2 
Hòa tan 0,25 mol HRP trong Carbonate buffer 
pH 8,8, nồng độ 0,2M chứa KCl 0,15M. Để 
tạo phức hợp gắn HRP với P4 tiến hành theo 
các bƣớc sau: 
- Pha dung dịch 1 và 2 với tỷ lệ 1:1, lắc trong 
vòng 1 giờ. Hỗn hợp thu đƣợc đem ly tâm ở 
2800 vòng/phút trong 10 phút. 
- Hoạt hóa P4 bằng hỗn hợp 2 chất NHS và 
DCC để tạo thành P4 hoạt động có các vị trí 
có khả năng gắn kết với HRP, từ đó tạo thành 
phức hợp HRP-P4. Cô đặc phức hợp thu đƣợc 
bằng ống concentrator-centripre-10 sau khi ly 
tâm bỏ kết tủa tách đƣợc phức hợp HRP-P4. 
Để loại bỏ P4 và HRP tự do trong dung dịch, 
cho hỗn hợp chạy qua cột Sephadex G50 và 
elute bằng dung dịch BPS có pH 7,4, tốc độ 
6ml/giờ, sản phẩm thu đƣợc trình bày ở bảng 1. 
Sau khi tiến hành gắn HRP với P4 đã đƣợc 
hoạt hóa P4 bằng hỗn hợp NHS và DCC để 
tạo thành P4 hoạt động với các vị trí có khả 
năng gắn kết với HRP. Trong lần gắn thứ 
nhất, lƣợng phức hợp trƣớc khi gắn là 5ml, 
sau khi cô đặc còn 1,30ml. Ở lần gắn thứ 2, 
lƣợng hỗn hợp trƣớc khi gắn là 3ml, sau khi 
cô đặc còn 0,75ml. 
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
67 
Bảng 1. Kết quả gắn phức hợp HRP với P4 
Lần gắn Phức hợp trƣớc 
khi gắn 
Phức hợp 
sau khi gắn 
Phức hợp sau khi chạy 
cột Sephadex G50 
Phức hợp sau 
khi cô đặc 
I 5ml 4,6ml 15ml 1,30ml 
II 3ml 2,7ml 9ml 0,75ml 
Nhƣ vậy khi gắn HRP với P4 với tỷ lệ dung 
dịch 1 và 2 là 1:1 cho kết quả phức hợp khả 
quan. Sau khi phức hợp HRP-P4 chạy qua cột 
Sephadex G50 sản phẩm gắn sau 2 lần thí 
nghiệm đạt 2,05ml, kết quả này tƣơng đƣơng 
với kết quả của Isobe và cs (2008)[]. 
Xác định đƣờng cong chuẩn 
- Làm phản ứng ELISA 
+ Pha loãng kháng thể đế nồng độ 4g/ml bằng 
dung dịch đệm carbonate. 
+ Cho 100 µl kháng thể đã pha loãng ở trên 
vào mỗi giếng. Bọc kín phiến nhựa bằng film 
dính (tránh bay hơi) và ủ ở nhiệt độ phòng 
trong 2 ngày. Trong thời gian này, kháng thể 
sẽ bám vào đáy và thành giếng. 
+ Đổ bỏ dung dịch trong các giếng, rửa 3 lần 
bằng dung dịch nƣớc sinh lý. 
+ Cho 200 µl dung dịch Blocking để gắn chặt 
kháng thể vào đáy và thành giếng. 
+ Đổ bỏ dung dịch trong các giếng, làm khô 
hoàn toàn, bọc kín phiến nhựa bằng film để 
tránh hút ẩm và bảo quản ở 40C sử dụng cho 
phản ứng ELISA. 
+ Bỏ lớp film bọc phiến nhựa, cho 50 µl dung 
dịch chuẩn vào giếng 
+ Cho 50 µl dung dịch HRP-P4 vào giếng 
+ Cho 50µl dung dịch kháng thể kháng lại P4 
+. Bọc kín phiến nhựa bằng film để tránh bay 
hơi và lắc nhẹ trong 1 phút bằng máy votex 
(500 vòng/phút) để các dung dịch trong giếng 
trộn đều với nhau. 
+ Ủ giếng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm ít nhất 
2 giờ hoặc ủ qua đêm trong tủ lạnh 40C để tạo 
ra sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể-kháng 
nguyên. Ở đây có sự cạnh tranh giữa kháng 
nguyên gắn enzyme và kháng nguyên không 
gắn enzyme cùng kết hợp với kháng thể. 
+ Đổ bỏ dung dịch trong giếng và rửa bằng 
nƣớc cất 3 lần để loại bỏ phần không kết hợp. 
+ Cho vào mỗi giếng 150µl dung dịch OPD. 
+ Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút để cho 
phản ứng giữa cơ chất là OPD với enzyme 
xảy ra. Sản phẩm của phản ứng có màu nâu. 
Càng nhiều HRP-P4 gắn với kháng thể thì 
màu của phản ứng càng đậm, tƣơng ứng với 
nồng độ P4 trong mẫu càng thấp. 
+ Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 6N 
và đọc màu trên quang phổ kế Opsys 
MR
TM
DYNEX trên máy vi tính. 
Đƣờng cong chuẩn đƣợc tính dựa trên mối 
tƣơng quan giữa mật độ quang học (OD) và 
nồng độ của dãy chuẩn. Căn cứ đƣờng cong 
chuẩn và mật độ quang học, ta tính đƣợc nồng 
độ P4 có trong máu, kết quả thể hiện ở bảng 2. 
Kết quả xác định độ pha loãng thích hợp 
của HRP-P4 tự gắn 
Sau khi tạo đƣợc phức hợp HRP-P4, tách 
chiết, cô đặc và bảo quản chế phẩm sử dụng 
trong phản ứng ELISA-P4 nhằm thay thế 
HRP-P4 nhập ngoại. Các bƣớc tiến hành : 
Xác định nồng độ chế phẩm HRP-P4 tự gắn 
ở tỷ lệ pha loãng từ 1/500 -1/500000 
Xác định nồng độ pha loãng thích hợp trên cơ 
sở tiến hành làm phản ứng ELISA và so sánh 
với HRP-P4 chuẩn. 
HRP-P4 chuẩn đƣợc pha với tỷ lệ 1/50000 (1 
phần HRP-P4 đƣợc pha với 49999 AB). 
HRP-P4 tự gắn đƣợc pha loãng với dung 
dịch Assay Buffer (AB) theo các tỷ lệ : 
1/5000 ; 1/10000 ; 1/50000 ; 1/100000 và 
1/500000. Cách pha các nồng độ đối với 
HRP-P4 tự gắn tƣơng tự nhƣ cách pha 
1/500000 của HRP-P4 chuẩn. 
Kết quả so sánh tỷ lệ tỷ lệ pha loãng HRP-P4 
tự gắn với HRP-P4 chuẩn đƣợc thể hiện ở 
bảng 3. 
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
68 
Bảng 2. Kết quả định lượng HRP-P4 chuẩn dựa trên nồng độ dãy chuẩn 
OD 
HRP-P4 chuẩn 1/5.10
4
 Nồng độ P4 ng/ml 
1663 0,01 
1756 0.03 
1840 0,1 
1745 0,3 
1588 1,0 
1257 3,0 
896 10 
648 30 
Bảng 3. Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở ty lệ pha loãng từ 1/500-1/500000 với HRP-P4 chuẩn 
P4 chuẩn 
(ng/ml) 
HRP-P4 
chuẩn 
1/50000 
HRP-P4 tự gắn 
1/5000 1/10000 1/50000 1/100000 1/500000 
0,01 1660 2889 2634 2338 2040 1655 
0,03 1754 2951 2745 2412 2129 1762 
0,1 1843 2859 2566 2274 2128 1855 
0,3 1746 2674 2439 2159 1988 1776 
1 1583 2460 2158 1868 1750 1578 
3 1254 2209 1958 1630 1396 1247 
10 893 1914 1609 1353 1146 897 
30 643 1582 1208 1034 893 655 
Bảng 4. Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở tỷ lệ 1/500000-1/1000000 với HRP-P4 chuẩn 
P4 chuẩn 
(ng/ml) 
HRP-P4 
chuẩn 
1/50000 
HRP-P4 tự gắn 
1/500000 1/600000 1/700000 1/800000 1/1000000 
0,01 1668 1665 1373 1036 0795 0649 
0,03 1747 1762 1473 1142 0871 0786 
0,1 1848 1845 1315 1023 0875 0764 
0,3 1756 1776 1183 0856 0812 0651 
1 1588 1578 0981 0755 0675 0533 
3 1263 1257 0767 0654 0531 0456 
10 0897 0878 0651 0553 0500 0447 
30 0648 0650 0427 0405 0396 0374 
Số liệu thu đƣợc ở bảng 3 cho thấy: Khi pha 
loãng HRP-P4 tự gắn ở mức 1/5000, 1/10000 
nhận thấy giá trị OD trung bình cao hơn nhiều 
so với HRP-P4 chuẩn. 
Độ pha loãng 1/5000, với nồng độ P4 là 
30ng/ml thì giá trị OD của HRP-P4 tự gắn đạt 
1582, tƣơng đƣơng với giá trị OD ở nồng độ 
1ng/ml (1583) của HRP-P4 chuẩn. 
Độ pha loãng 1/10000, với nồng độ P4 là 
30ng/ml thì giá trị OD của HRP-P4 tự gắn đạt 
1208, tƣơng đƣơng với giá trị OD ở nồng độ 
3ng/ml của HRP-P4 chuẩn. 
Nhƣ vậy, khi tăng nồng độ pha loãng của 
HRP-P4 tự gắn so với nồng độ HRP-P4 chuẩn 
đã làm tăng mức độ chênh lệch giá trị OD. 
Tuy nhiên, ở mức pha loãng 1/500000 của 
HRP-P4 tự gắn, giá trị OD tƣơng đƣơng so 
với mức pha loãng 1/50000 của HRP-P4 
chuẩn cùng nồng độ của P4 chuẩn. 
Xác định nồng độ chế phẩm HRP-P4 tự gắn 
ở tỷ lệ pha loãng từ 1/500000-1/1000000 
Để xác định chính xác độ pha loãng thích hợp 
của HRP-P4 tự gắn. Thí nghiệm đƣợc tiến 
hành lặp lại ở độ pha loãng 1/500000 và với 
các độ pha loãng cao hơn: 1/600000; 
1/700000; 1/800000; 1/1000000. Kết quả thu 
đƣợc trình bày ở bảng 4. 
Độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở mức 
1/500000, cho kết quả giá trị OD trung bình 
tƣơng đƣợc với HRP-P4 chuẩn (648 và 650). 
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
69 
Khi pha HRP-P4 tự chế loãng hơn 1/600000 
(427); 1/700000 (405); 1/800000 (396); 
1/1000000 (374) thấy kết quả OD trung bình 
thấp hơn nhiều so với HRP-P4 chuẩn. 
Từ kết quả ở bảng 3 và 4, hình 2 và hình 3, 
nhận thấy HRP-P4 tự chế với độ pha loãng 
1/500000, giá trị OD trung bình tƣơng đƣơng 
với HRP-P4 chuẩn ở nồng độ P4 chuẩn 
30ng/ml. Kết quả này cần đƣợc thử nghiệm 
trong phản ứng ELISA để chẩn đoán có thai 
sớm ở bò sữa thay thể HRP-P4 nhập ngoại. 
Kết quả ứng dụng HRP-P4 tự gắn để xác 
định tình trạng động dục, có thai sớm ở bò 
sữa sau 21 ngày phối giống 
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 29 bò lai 
hƣớng sữa F2, F3 sinh sản bình thƣờng, 4-6 
tuổi, đã đẻ 1-2 lứa. Các mẫu sữa đƣợc lấy vào 
ngày động dục (ngày 0), ngày 7, ngày 15 và 
21 sau phối giống. Sau khi có kết quả định 
lƣợng về hàm lƣợng progesterone, những bò 
có hàm lƣợng progesterone tƣơng đƣơng 
trong các ngày lấy mẫu thì ghép thành 1 
nhóm để khám thai đối chứng ở ngày 45. Kết 
quả thể hiện ở bảng 5. 
Số liệu ở bảng 5 cho thấy: 
+) Nhóm 16 trong 29 bò có hàm lƣợng P4 vào 
ngày động dục dao động 0,25-0,28ng/ml, 
ngày 7 hàm lƣợng P4 tăng nhanh và đạt đỉnh 
cao vào ngày 15, 21 và 25 từ 1,65-2,41ng/ml 
đƣợc chẩn đoán đã có thai. Theo Phan Văn 
Kiểm và CS, (2003) [1], nếu hàm lƣợng P4 
vào ngày động dục và phối giống thấp 
(<0,35ng/ml) và tăng cao từ ngày 7, 15, 21 và 
25 thì tỷ lệ đậu thai đạt 85%. Nhƣ vậy kết quả 
xác định hàm lƣợng P4 ở đề tài này tƣơng 
đƣơng với kết quả đã công bố của tác giả trên 
và phù hợp với kết quả khám thai sau 45 ngày.. 
+) Nhóm 7 trong số 29 bò có hàm lƣợng P4 
vào ngày động dục thấp 0,21-0,22ng/ml, hàm 
lƣợng tăng dần từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 15 
từ 0,60-1,35ng/ml, song từ ngày thứ 21 đến 
ngày 25 thì hàm lƣợng P4 giảm mạnh từ 0,67 
xuống còn 0,32ng/ml. Với nồng độ P4 thấp ở 
ngày 21 sau phối giống có thể xác định là 
không có thai, kết quả phù hợp với kết quả 
khám thai sau 45 ngày. 
+) Nhóm 3 trong số 29 bò có hàm lƣợng P4 
vào ngày động dục, ngày 7, ngày 15, ngày 21 và 
ngày 25 thấp (từ 0,15-0,23ng/ml). Nhƣng thực 
tế bò này không động dục (phối giống nhầm) 
Bảng 5. Hàm lượng P4 ở bò sau khi phối giống 
Nhóm TN n 
Hàm lƣợng P4 trong sữa (ng/ml) (
X
mX ) 
Kết 
quả 
khám 
thai Ngày 0 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 21 Ngày 25 
HRP-P4 
tự gắn 
16 0,25 ± 0,02 0,88 ± 0,02 1,65 ± 0,03 1,83 ± 0,03 2,41± 0,05 16 
HRP-P4 
nhập ngoại 
16 0,28 ± 0,03 0,91 ± 0,02 1,55 ± 0,02 1,72 ±0,02 2,38 ±0,03 16 
HRP-P4 tự 
gắn 
7 0,22 ± 0,02 0,61 ± 0,03 1,15 ± 0,02 0,58 ±0,02 0,36 ±0,02 0 
HRP-P4 
nhập ngoại 
7 0,21 ± 0,02 0,60 ± 0,03 1,35 ± 0,06 0,67 ±0,04 0,32 ±0,01 0 
HRP-P4 tự 
gắn 
3 0,15 ± 0,01 0,18 ± 0,01 0,21 ± 0,03 0,20 ±0,02 0,23 ±0,03 0 
HRP-P4 
nhập ngoại 
3 0,18 ± 0,03 0,17 ± 0,02 0,23 ± 0,01 0,22 ±0,03 0,26 ±0,02 0 
HRP-P4 tự 
gắn 
3 1,25 ± 0,04 1,35 ± 0,05 1,32 ± 0,02 1,45 ±0,06 1,33 ±0,05 0 
HRP-P4 
nhập ngoại 
3 1,27 ± 0,05 1,32 ± 0,03 1,36 ± 0,07 1,41 ±0,04 1,32 ±0,05 0 
Tổng 29 
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
70 
+) Nhóm 3 trong 29 bò có hàm lƣợng P4 vào 
ngày động dục, ngày 7, ngày 15, ngày 21 và 
ngày 25 cao (từ 1,25-1,45ng/ml). Chứng tỏ bò 
này thể vàng đang hoạt động, dẫn tinh viên đã 
chẩn đoán nhầm và phối giống sai. 
Theo Isobe và cs, (2002) [2], qua hàm lƣợng 
P4 trong mẫu xét nghiệm cao hay thấp có thể 
biết tình trạng hoạt động của buồng trứng của 
bò sữa, bình thƣơng hay không bình thƣờng, 
có thể vàng hay không có thể vàng, từ đó có 
biện pháp xử lý thích hợp. Phan Văn Kiểm và 
cs, (2003) [1], hàm lƣợng P4 vào ngày động 
dục và phối thƣờng thấp (0,1-0,35ng/ml), hàm 
lƣợng này bắt đầu tăng vào ngày thứ 4, thứ 5 
của chu kỳ, tiếp tục tăng từ ngày 7 đến ngày 21, 
25 cao (>1ng/ml) chứng tỏ bò đã mang thai. 
Nhƣ vậy, nếu hàm lƣợng P4 ở bò vào ngày 
động dục và phối giống thấp (0,21-0,22ng/ml) 
ngày 7 đến ngày 15 tăng cao (>1ng/ml) và 
ngày 21 đến ngày 25 vẫn duy trì và tăng cao 
(>1ng/ml) chẩn đoán bò đã mang thai. 
Từ kết quả thu đƣợc nhận thấy: khi sử dụng 
HRP-P4 tự gắn kết quả thu đƣợc tƣơng đƣơng 
so với HRP-P4 nhập ngoại song độ biến động 
nhỏ hơn, kết quả của hai phƣơng pháp là 
tƣơng đƣơng nhau và có thể dùng một trong 
hai HRP-P4 xét nghiệm P4 để chẩn đoán thời 
điểm bò động dục, mang thai hay không 
mang thai sau phối giống từ ngày thứ 21. Kỹ 
thuật này cũng cho phép kiểm tra tay nghề 
của các kỹ thuật viên thụ tinh nhân tạo. 
KẾT LUẬN 
Đề tài đã gắn thành công phức hợp HRP-P4 
theo quy trình của ISobe.N và cs, (2002) [2]. 
Kết quả thu đƣợc khi gắn HRP với P4 với tỷ 
lệ dung dịch 1 và dung dịch 2 là 1: 1 cho kết 
quả phức hợp khả quan. Sản phẩm thu đƣợc 
đạt thể tích 2,05ml HRP-P4 đậm đặc. 
Độ pha loãng thích hợp nhất đối với HRP-P4 
tự gắn đƣợc xác định với tỷ lệ là 1/500000. 
Với tỷ lệ pha loãng 1/500000 của HRP-P4 tự 
gắn, hàm lƣợng P4 đƣợc xác đinh trong phản 
ứng ELISA-P4 cho kết quả tƣơng đƣơng với 
hàm lƣợng P4 trong HRP-P4 nhập ngoại. Có 
thể thay thế HRP-P4 ngoại nhập bằng HRP-P4 
tự gắn trong các xét nghiệm EIA-P4. 
Sử dụng HRP-P4 tự gắn để chẩn đoán tình 
trạng động dục và chẩn đoán có thai sớm ở bò 
cái sinh sản sau phối giống cho kết quả chính 
xác. Đối với bò cái sinh sản bình thƣờng, ở 
thời điểm động dục, hàm lƣợng P4 thấp dƣới 
0,3 ng/ml (nhóm 16 bò có hàm lƣợng P4 từ 
0,25-0,28ng/ml), sau phối giống 7 ngày hàm 
lƣợng P4 đạt 0,88 mg/ml và tăng nhanh đạt 
1,83 ng/ml và tiếp tục tăng cao ở những ngày 
tiếp theo. Những bò có hàm lƣợng P4 biến 
động theo quy luật trên có thể chẩn đoán là có 
chửa sau phối giống 21 ngày. 
Sử dụng HRP-P4 tự gắn có thể thay thế HRP-
P4 nhập ngoại trong bộ Kit EIA-P4 để định 
lƣợng hàm lƣợng P4 trong chẩn đoán có thai 
sớm ở bò. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Phan Văn Kiểm, Tăng Xuân Lƣu, Trịnh Quang 
Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa (2003) ―Ứng 
dụng kết quả nghiên cứu hàm lƣợng P4 để chấn 
đoán và điều trị rối loạn sinh sản bò sữa‖, Hội 
nghị Công nghệ sinh sản toàn quốc, Hà Nội. 
2. Isobe. N, Nakao.T (2002), ―Direct Enzym 
Immunoassay of estron sulphate in the plasma of 
cattle‖, Hiroshima, Japan 
3. Isobe. N, Nakao.T (2002), ―Theory and 
application of ELISA”, Hiroshima, Japan
Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 
71 
SUMMARY 
RESEARCH TO MAKE THE SELL-ATTACHED HORSE RADISH 
PEROXYDASE-PROGESTERONE USING IN THE KIT EIA-P4 AND APPLYING 
IN ODER TO DIAGNOSE THE EARLY PREGNANT OF COWS 
Nguyen Manh Ha
1*
, Phan Van Kiem
2 
1College of Agriculture and Forestry – TNU, 
The subject research to make the Horse Radish Peroxydase-progesterone (HRP) using for ELISA 
reaction in order to determine progesterone (P4) concentration. The result after two times of 
attachment received 2.05 ml composite of solid HRP-P4 (sell- attached HRP-P4). After 
determining the standard curve, the subject determined the suitable dilution rate of sell-attached 
HRP-P4 using for reaction ELISA is 1/500000. 
Using sell-attached HRP-P4 for ELISA reaction to determine concentration P4 in order to diagnose 
early pregnant with 29 reproductive cross-bred cows F2, F3. 16 cows are diagnosed pregnancy that 
have P4 concentration from 0.25ng/ml to 0.28ng/ml in estrus day (day 0), then increase quickly 
geting 0.88ng/ml at 7
th
, 1.83 ng/ml in 21
st
 and 2.41 ng/ml in day 25
th
 after insemination. 
Using sell-attached HRP-P4 can be able to replace HRP-P4 import in EIA-P4 Kit in ELISA reaction 
to determine concentration P4 in order to diagnose the early pregnant of cow. 
Key word: Horse Radish Peroxydase-Progesterone, diagnose early pregnant in cow 
Ngày nhận bài:26/11/2013; Ngày phản biện:10/12/2013; Ngày duyệt đăng: 07/02/2014 
Phản biện khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan – Trường Đại học Nông Lâm - ĐHTN
*
 Tel: 0912 004814