Kinh nghiệm xây dựng và phát triển PCR/real-Time PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu và chẩn đoán

 146 
Kinh nghiệm xây dựng và phát triển PCR/real-time PCR và một số 
kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu và chẩn đoán 
Từ các yêu cầu thực tế phải tiếp cận nền y học hiện đại trong chẩn đoán và điều trị 
1. Cần một giải pháp toàn diện về chẩn đoán sinh học phân tử bệnh viêm gan 
virus B và viêm gan virus C mạn tính 
Bệnh viêm gan virus B và viêm gan virus C mạn tính là hậu quả của tình trạng 
nhiễm virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) và virus viêm gan C (HCV=hepatitis 
C virus) gây ra. Bệnh nhân có thể bị nhiễm HBV và HCV qua đường máu như tiêm 
chích, truyền máu, nhổ răng, châm cứu, làm móng, hay các thủ thuật xâm lấn... bởi các 
dụng cụ bị nhiễm virus. Ngoài ra, nhiễm trùng HBV và HCV còn có thể xãy ra qua con 
đường tình dục, mẹ truyền qua con khi sinh nở... 
Theo các thông tin từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới và một số nhà nghiên cứu trong và 
ngoài nước, Việt Nam là một trong những quốc gia đứng hàng đầu về tần suất nhiễm 
HBV qua xét nghiệm phát hiện kháng nguyên bề mặt của virus (HBsAg) trong máu, 
với tỷ lệ người bình thường có HBsAg dương tính là 10-30%. Thường diễn tiến tự 
nhiên của một người bị nhiễm HBV là đa số tự khỏi do hệ thống miễn dịch tạo được 
kháng thể bảo vệ là kháng thể đặc hiệu HBsAg. Chỉ có một số ít, hệ thống miễn dịch 
cơ thể của họ không thể 
nhận diện được kháng 
nguyên bề mặt của virus là 
kháng nguyên lạ để có thể 
tạo được đáp ứng miễn dịch 
do vậy mà các người này bị 
mang HBV trong cơ thể lâu 
dài và lúc nào xét nghiệm 
phát hiện HBsAg cũng 
dương tính. Nếu không có 
các tác nhân nguy cơ gây 
tổn hại tế bào gan (như uống 
rượu, béo phì, gan nhiễm 
Sơ đồ 4: Hướng dẫn các chỉ định xét nghiệm để điều trị và theo dõi 
hiệu quả điều trị đặc hiệu bệnh nhân bị bệnh viêm gan 
virus B mạn tính 
 147 
mở, hay bị các tác nhân lý hoá khác) thì HBV chỉ nhân bản thành các virus không hoàn 
chỉnh (chỉ có vỏ capsid mà không có lõi DNA) và tạo được một số lượng rất giới hạn 
các virus hoàn chỉnh, do vậy họ chỉ là các người lành mang HBV mà thôi (carrier) chứ 
không phát triển thành viêm gan mạn tính. Tuy nhiên nếu có các nguy cơ thương tổn tế 
bào gan xãy ra thì HBV sẽ phát triển nhiều hơn trong tế bào gan, do vậy lượng virus 
hoàn chỉnh sẽ được phóng thích nhiều hơn vào trong máu (³105 copies/1ml máu) đồng 
thời gây tổn hại tế bào gan để trở thành bệnh viêm gan mạn tính. Nếu không kiểm soát 
được sự nhân bản của HBV thì viêm gan mạn tính sẽ dẫn đến hậu quả khó tránh khỏi là 
xơ gan rồi có thể dẫn đến ung thư gan hay đi thẳng đến ung thư gan. 
Do vậy, trước một người có xét nghiệm HBsAg dương tính thì các nhà lâm sàng 
nhất thiết phải cho chỉ định làm thử nghiệm xác định xem trong máu của người nhiễm 
có mang HBV hoàn chỉnh hay không bằng xét nghiệm PCR phát hiện HBV-DNA, và 
nếu dương tính thì phải biết số lượng HBV hoàn chỉnh có trên 105 copies/1ml hay 
không bằng xét nghiệm qPCR để định lượng HBV-DNA. Nếu lượng HBV trong máu 
dưới 105 thì không cần thiết phải điều trị vì HBV vẫn còn nhân bản rất giới hạn trong tế 
bào gan và chưa gây tổn hại tế bào gan. Nhưng nếu lượng virus ³105 thì cần phải xem 
xét gan có bị tổn thương chưa thông qua xét nghiệm men gan ALT. Nếu lượng ALT 
vượt quá bình thường (1,5 hay tối đa là 2 lần bình thường, ở nam bình thường là 33UI 
còn ở nữ bình thường là 19IU) thì phải cho chỉ định điều trị bằng thuốc kháng virus 
như lamivudine, adefovir, entecavir, interferon.. hay sử dụng ngay từ ban đầu liệu pháp 
kết hợp lamivudine với adefovir, với entecavir, hay với interferon. Nếu lượng ALT vẫn 
còn bình thường thì phải làm sinh thiết gan để làm xét nghiệm giải phẩu bệnh xem gan 
có bị thương tổn mô học không, hay nếu không muốn làm sinh thiết gan thì có thể làm 
fibroscan gan của bệnh nhân và giá trị fibroscan cũng có thể cho biết tình trạng tổn hại 
mô gan dù không chính xác bằng sinh thiết gan. Ngoài ra, cũng cần thiết phải làm thêm 
thử nghiệm định lượng AFP (alpha foeto-protein) trên các bệnh nhân này vì chỉ cần có 
bằng chứng mô học có tổn thương gan hay lượng AFP vượt quá giới hạn bình thường 
thì vẫn phải cho chỉ định điều trị bệnh nhân bằng thuốc kháng virus như trên. Hiện nay 
các nhà điều trị không còn ảo vọng trị sạch được HBV ra khỏi cơ thể bệnh nhân vì 
nhiễm HBV rất dễ dàng bị tái phát sau khi ngưng điều trị. Lý do chính yếu là vì HBV 
luôn tồn tại trong nhân tế bào gan dưới dạng cccDNA (covalently closed circular 
 148 
DNA) để làm nguồn gốc di truyền của virus, và dạng này không hề bị tác động bởi các 
thuốc kháng virus là các nucleosides analogs hiện nay. Tuy nhiên vì có nhiều bằng 
chứng cho thấy nếu không kiểm soát mà để lượng HBV hoàn chỉnh trong máu lên quá 
cao thì bệnh viêm gan mạn tính sẽ có nguy cơ diễn tiến đến suy gan mất bù, hay xơ gan 
tiến triển hoặc ung thư gan. Do vậy, sau khi đã bắt đầu điều trị bệnh nhân bị viêm gan 
virus B mạn tính, các nhà điều trị phải thường xuyên theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu 
mà họ đã cho trên bệnh nhân bằng cách phải định kỳ mỗi 3 tháng cho bệnh nhân làm 
xét nghiệm qPCR định lượng HBV-DNA (nếu lượng HBV-DNA vẫn còn định lượng 
được) hay PCR định tính phát hiện HBV-DNA (nếu HBV-DNA dưới ngưỡng phát 
hiện định lượng) cho đến khi nào lượng HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện. Quan điểm 
của các nhà điều trị hiện nay là phải liên tục duy trì liệu pháp kháng virus để khống chế 
lượng virus dưới mức phát hiện do vậy mà phải luôn theo dõi sự tái xuất hiện virus 
bằng xét nghiệm PCR phát hiện HBV-DNA trong máu của bệnh nhân định kỳ mỗi 3 
tháng. Nếu sau một thời gian điều trị đặc hiệu (thường là 3 tháng) mà lượng virus 
không giảm quá 2 log (100 lần), hay không đạt đến ngưỡng 103/ml, hay trong quá trình 
điều trị, xét nghiệm HBV-DNA dương tính trở lại, bác sĩ điều trị phải nghĩ đến khả 
năng virus kháng thuốc, đặc biệt là kháng lamivudine. Lúc này xét nghiệm sinh học 
phân tử mà bác sĩ nên chỉ định thực hiện trên bệnh nhân là xét nghiệm định genotype 
và phát hiện các đột biến kháng lamivudine, adefovir và entecavir trên virus HBV của 
bệnh nhân để tuỳ thuộc 
vào genotype đột biến 
mà có thể điều chỉnh 
liệu pháp kháng virus 
thích hợp. Trước đây, 
các nhà lâm sàng 
thường đánh giá hiệu 
quả điều trị đặc hiệu 
qua xét nghiệm miễn 
dịch cho biết có dấu 
hiệu chuyển đảo huyết 
thanh trên bệnh nhân, 
Sơ đồ 5: Sơ đồ hướng dẫn chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu 
bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính 
 149 
nghĩa là HBeAg (kháng nguyên tiết của HBV - một thông số cho biết có tình trạng 
virus nhân bản) trở nên âm tính và xuất hiện kháng thể kháng HBe. Tuy nhiên vì HBV 
có thể có đột biến precore làm cho virus không thể tạo ra được kháng nguyên HBe mà 
vẫn có được kháng thể kháng HBe nên muốn xác định được chắc chắn có chuyển đảo 
huyết thanh thật sự hay không thì các nhà lâm sàng phải chỉ định xét nghiệm phát hiện 
đột biến precore trên các bệnh nhân HBeAg [-], có kháng thể kháng HBeAg, mà HBV-
DNA vẫn còn [+]. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cũng cho biết rằng đột biến 
precore (vị trí 1896) và đặc biệt là core-promoter (vị trí 1762/64) có liên quan đến diễn 
tiến viêm gan mạn tính, xơ gan, và ung thư gan trên bệnh nhân. Do vậy xét nghiệm 
sinh học phân tử phát hiện đột biến precore hiện nay cũng là một yêu cầu thực tiến từ 
các nhà điều trị. Sơ đồ 4 là một tóm tắt qui trình cho các chỉ định xét nghiệm để điều trị 
và theo dõi điều trị viêm gan B mạn tính. 
Ngoài viêm gan B, nhiễm viêm gan virus C cũng là một vấn đề rất cần được quan 
tâm hiện nay, đặc biệt tại Việt Nam. Theo ghi nhận về tình hình nhiễm viêm gan C thì 
tỷ lệ người bình thường ở Việt Nam nhiễm virus viêm gan C là khoảng 2-10%, xem 
như là thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C cao thứ nhì trên thế 
giới. Khác với nhiễm viêm gan B với đa số các trường hợp người nhiễm tạo được 
kháng thể bảo vệ loại trừ được virus hay là một số ít hơn trở thành người lành mang 
trùng; có đến 85% người nhiễm viêm gan virus C không có miễn dịch bảo vệ, dù có 
xuất hiện kháng thể đặc hiệu (anti-HCV [+]), bị diễn tiến đến viêm gan mạn tính rồi 
đến xơ gan với 20% trong số đó có nguy cơ diễn tiến đến ung thư gan. Do vậy mà dù 
tỷ lệ người nhiễm viêm gan C tại Việt Nam thấp hơn nhiễm viêm gan B nhưng tình 
trạng bệnh tật do nhiễm virus viêm gan C mang lại là khá cao, không thua mà thậm chí 
còn hơn viêm gan B. Nguy hiểm như vậy nhưng bệnh viêm gan C mạn tính lại là một 
bệnh mà dưới ánh sáng của y học hiện đại lại là một bệnh có thể chữa khỏi được hoàn 
toàn với xác suất thành công có thể đến 60%. Tuy nhiên, để có thể cho được chỉ định 
điều trị đặc hiệu viêm gan C mạn tính bằng interferon a phối hợp với ribavirin là phát 
đồ chuẩn nhất hiện nay, bác sĩ cần phải xác định là bệnh nhân đang mang virus viêm 
gan C trong máu bằng xét nghiệm định tính HCV-RNA vì xét nghiệm anti-HCV chỉ là 
xét nghiệm sàng lọc trong cho và truyền máu chứ không phải là xét nghiệm trong chẩn 
đoán lâm sàng, hơn nữa một người có kết quả anti-HCV [+] vẫn có thể không mang 
 150 
virus viêm gan C mà chỉ là kết quả của tình trạng nhiễm mầm bệnh trước đó và nay đã 
khỏi. Sau khi xác định được người bệnh dương tính HCV-RNA, trước khi cho chỉ định 
điều trị bác sĩ cần phải làm thêm hai xét nghiệm nữa là định lượng HCV-RNA và định 
genotype của virus. Lý do là vì bác sĩ cần phải đánh giá hiệu quả điều trị mà mình đã 
cho trên bệnh nhân sau 1 tháng rồi sau 3 tháng điều trị và phương pháp đánh giá là 
định lượng lại HCV-RNA. Nếu kết quả định lượng cho thấy virus biến mất sau 1 tháng 
điều trị thì đây là đáp ứng siêu vi nhanh với dự hậu thành công trong điều trị rất tốt. 
Nếu lượng virus giảm trên 100 lần (trên hay bằng 2 log) sau 3 tháng bắt đầu điều trị thì 
đây là đáp ứng siêu vi sớm và có thể đánh giá điều trị đã cho là hiệu quả và có thể tiếp 
tục. Nếu lượng virus không giảm quá 2 log thì có thể phương pháp điều trị đã cho trên 
bệnh nhân là không hiệu quả và cần phải cân nhắc để điều chỉnh (dùng loại interferon 
a khác có dược động và dược lực tốt hơn, bắt buộc bệnh nhân phải tuân thủ hơn...). Để 
quyết định thời gian điều trị là bao lâu thì bác sĩ cần phải biết genotype của HCV trên 
bệnh nhân, nếu là genotype 1 thì cần phải duy trì thời gian điều trị là 48 tuần hay hơn, 
còn nếu thuộc genotype khác thì thời gian điều trị có thể ngắn hơn là 24 tuần. Sau khi 
hoàn tất thời gian cần phải điều trị trên bệnh nhân, trước khi quyết định ngưng điều trị, 
bác sĩ cần phải xác định xem bệnh nhân đã sạch HCV-RNA chưa bằng xét nghiệm 
định tính HCV-RNA và chỉ ngưng điều trị khi HCV-RNA hoàn toàn âm tính. Sau khi 
đã ngưng điều trị vì bệnh nhân đã sạch virus, bác sĩ vẫn phải khuyến cáo bệnh nhân 
làm xét nghiệm định đính HCV-RNA mỗi 3 tháng một lần để theo dõi xem bệnh nhân 
có bị tái phát không. Bất cứ lúc nào HCV-RNA dương tính lại thì đó là dấu hiệu tái 
phát và khi ấy có thể bác sĩ phải xem xét điều trị lại cho bệnh nhân và cũng phải theo 
thực hiện lại qui trình xét nghiệm như trên. Sơ đồ 5 tóm tắt qui trình nêu trên. 
2. Cần xét nghiệm kịp thời và nhạy cảm hơn để chẩn đoán phát hiện các tác nhân 
vi sinh gây bệnh mà các phương tiên vi sinh hay miễn dịch không hữu hiệu 
Bên cạnh bệnh viêm gan mạn tính do virus B và virus C, y học Việt Nam cũng còn 
phải đối phó với các bệnh nhiễm trùng khác mà vấn đề phát hiện các tác nhân vi sinh 
gây bệnh rất cần thiết phải có phương tiện xét nghiệm nhạy cảm hơn, kịp thời hơn, và 
an toàn hơn. 
Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới, Việt Nam chúng ta là một trong 22 nước 
mang gánh nặng nhiễm lao cao nhất trên thế giới. Ngoài ra với tình trạng gia tăng tỷ lệ 
 151 
nhiễm HIV/AIDS hiện nay tại Việt Nam (có thể quá 300.000 theo dự đoán của Bộ Y 
Tế) thì nguy cơ chúng ta phải đối phó với tình trạng nhiễm lao tăng cao trong cộng 
đồng. Do vậy mà vấn đề nâng cao năng lực của các phòng thí nghiệm lâm sàng trong 
xét nghiệm phát hiện lao là một vấn đề mà y học Việt Nam phải đặt ra vì với phương 
pháp nhuộm tìm trực khuẩn kháng acid (AFB), độ nhạy phát hiện chỉ đạt 64% trong lao 
phổi, 27% trong lao ngoài phổi, và chỉ 9% trong lao màng não; hơn nữa nhuộm kháng 
acid bị phụ thuộc khá nhiều vào kỹ năng của người đọc lame và kết quả cũng không 
thể xác định được bệnh nhân có thật sự nhiễm lao hay không vì có thể có nhiều trực 
khuẩn kháng acid khác không phải vi khuẩn lao hiện diện trong bệnh phẩm. Với 
phương pháp nuôi cấy thì độ nhạy có thể cao hơn là 77% trong lao phổi, 67% trong lao 
ngoài phổi và 39% trong lao màng não nhưng thời gian để có được kết quả không thể 
trước 2 tuần nếu chúng ta sử dụng phương pháp cấy nhanh với môi trường MGITT hay 
phải trên 1 tháng nếu chúng ta sử dụng phương pháp cấy với môi trường Lowenstein 
Jensen. Chính vì vậy nên tại các bệnh viện hay phòng khám, có rất nhiều trường hợp 
bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng và X-quang rất nghi ngờ lao phổi, và hầu hết các 
trường hợp lâm sàng chẩn đoán nghi ngờ lao ngoài phổi hay lao màng não mà kết quả 
xét nghiệm bác sĩ nhận được vẫn thường là soi không thấy, cấy không ra. Thực tế này 
đã đòi hỏi các nhà lâm sàng phải yêu cầu xét nghiệm PCR phát hiện lao trong các bệnh 
phẩm khác nhau vì theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, PCR đã cải thiện đáng kể độ 
nhạy phát hiện lao không chỉ trong lao phổi mà cả trong lao ngoài phổi và lao màng 
não. Hơn nữa kết quả PCR cũng cho phép xác định ngay là nhiễm lao mà không cần 
phải làm thêm các xét nghiệm vi sinh xác định như là đối với phương pháp nhuộm 
kháng acid hay nuôi cấy, vì với PCR người làm xét nghiệm phát hiện đoạn DNA đích 
là chỉ đặc hiệu cho vi khuẩn lao chứ không phải cho các mycobacteria khác không phải 
lao. 
Một bệnh nhiễm khác mà thực tế đòi hỏi phải triển khai xét nghiệm khuếch đại 
nucleic acid trên cơ sở của kỹ thuật PCR để phát hiện tác nhân gây bệnh, đó là bệnh sốt 
Dengue gây sốt xuất huyết. Dĩ nhiên việc chẩn đoán lâm sàng một bệnh nhân có phải 
đang bị sốt Dengue gây sốt xuất huyết hay không thật sự không khó mấy một khi bệnh 
nhân đã xuất hiện các bất thường về số lượng tiểu cầu (giảm tiểu cầu) và dung tích 
hồng cầu (tăng dung tích hồng cầu) hay đã có các triệu chứng đi vào shock. Tuy nhiên 
 152 
để có thể phát hiện được bệnh nhân có phải sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue 
trong những ngày đầu của bệnh thật sự là cả một vấn đề nan giải vì ở giai đoạn sớm 
này về mặt lâm sàng hay cận lâm sàng, bệnh nhân không có biểu hiện gì đặc hiệu hơn 
là một sốt siêu vi. Thử nghiệm miễn dịch học phát hiện kháng thể đặc hiệu Dengue, 
thậm chí là kháng thể IgM, cũng chỉ có thể bắt đầu dương tính vào ngày thứ 4 hay 5 
của bệnh và lúc này thì kết quả xét nghiệm không còn hữu dụng lâm sàng nữa vì các 
biểu hiện lâm sàng của sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue đã khá rõ. Vì không thể 
chẩn đoán xác định được sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue trong những ngày đầu 
của bệnh nên có thể có hai tình huống: (1) Hoặc là bệnh nhân không được theo dõi để 
điều trị kịp thời và do vậy khi vào đến bệnh viện đã vào bệnh cảnh shock quá nặng và 
bác sĩ sẽ phải rất vất vả mới cứu được bệnh nhân hay sẽ trở tay không kịp; (2) Hoặc là 
trong mùa dịch sốt xuất huyết bệnh viện sẽ bị tràn ngập bệnh nhân vì lâm sàng nghi 
ngờ sốt xuất huyết mà chưa có bằng cớ chứng minh bệnh nhân đang bị sốt Dengue hay 
sốt xuất huyết Dengue. Do vậy thực tế  ... c phát triển 
và hoàn thiện các kit PCR và real-time PCR để đưa vào ứng dụng tại nhiều phòng thí 
nghiệm lâm sàng có trang bị PCR tại Việt Nam. Như đã nói ở trên, để đảm bảo được 
chất lượng cao một các đồng đều của xét nghiệm PCR và real-time PCR thực hiện 
được tại phòng thí nghiệm lâm sàng áp dụng cho chẩn đoán, thử nghiệm cũng như các 
kit do chúng tôi cung cấp để làm thử nghiệm phải luôn luôn có đầy đủ các chuẩn mực 
sau: (1) Kit khuếch đại đạt được độ nhạy cao và có bằng chứng để xác định độ nhạy 
thông qua chứng [+] được cung cấp với số copies xác định để người sử dụng có thể 
 159 
kiểm tra được. (2) Có chứng nội tại sử dụng chung mồi với nucleic acid đích được 
cung cấp với hàm lượng copies tối thiểu để người thực hiện thí nghiệm có thể cho vào 
mẫu chứng âm [-] là mẫu thật và thật sự âm tính rồi thực hiện xét nghiệm cùng với các 
mẫu thử nhờ vậy mà kiểm tra được quá trình xét nghiệm có bị ngoại nhiễm không 
trong suốt quá trình thao tác xét nghiệm cũng như chứng minh được độ nhạy của kit 
tách chiết cũng như kit khuếch đại. (3) Người thực hiện thí nghiệm còn có thể cho 
chứng nội tại vào PCR mix cùng với tách chiết của mẫu thử để có thể xác định được 
mẫu âm tính là âm tính thật sự mà không phải âm tính vì PCR bị ức chế. (4) Có hệ 
thống chống ngoại nhiễm bằng dUTP và UNG được pha chung vào PCR mix để sản 
phẩm khuếch đại bị phá huỷ không cho tham gia vào quá trình khuếch đại. (5) Trong 
PCR định lượng, ngoài các chuẩn trên, để đảm bảo xét nghiệm định lượng, các mẫu 
chuẩn biết rõ hàm lượng copies DNA đích cũng được cung cấp ở dạng bền vững với 
yêu cầu người làm xét nghiệm phải tự cho vào các PCR mix nhằm đánh giá được thao 
tác pipetting khi làm định lượng cũng như xây dựng được đường chuẩn trong mỗi lần 
làm xét nhiệm để tạo cơ xở định lượnh chính xác. 
Cho đến hiện nay, chúng tôi đã triển khai thực hiện các xét nghiệm PCR và real-
time PCR cũng như sản xuất được các kit tương ứng đạt được tất cả các chuẩn mực 
trên, đó là: 
(1) Xét nghiệm và kit PCR phát hiện HBV-DNA (hình 69) dựa trên khuếch đại 
đích 259bp trên gen S, đạt độ nhạy 10 copies/ml huyết thanh. Có chứng âm là huyết 
tương người bình thường, và 
chứng dương 100 copies/ml là 
plasmid chèn đúng đoạn DNA 
đích để chứng minh được độ 
nhạy của phản ứng đúng như 
khai báo. Có chứng nội tại là 
plasmid chèn DNA tái tổ hợp 
sử dụng cùng mồi nhưng cho 
sản phẩm khuếch đại khác biệt DNA đích với kích thước 195bp, được cung cấp ở 
lượng tối thiểu để kiểm soát độ nhạy của tách chiết, khuếch đại cũng như kiểm tra 
ngoại nhiễm, và xác định mẫu có bị âm tính vì ức chế không. 
Hình 69: Kết quả xét nghiệm PCR phát hiện HBV-DNA được 
thực hiện với NKHBV-PCR kit 
 160 
(2) Xét nghiệm và kit RT-PCR phát hiện HCV-RNA (hình 70) dựa trên khuếch 
đại một đoạn 240bp trên vùng 5’NC, đạt độ nhạy 50 copies/ml huyết thanh mà người 
sử dụng có thể kiểm chứng nhờ 
chứng [+] chứa 200copies/ml là 
plasmid chèn DNA đích. Có 
chứng nội tại là RNA phiên mã 
từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp 
kích thước 195bp khác biệt với 
DNA đích nhưng sử dụng cùng 
mồi. Chứng nội tại được cung 
cấp ở nồng độ tối thiểu để người làm thí nghiệm cho vào cùng với mẫu thử để được 
tách chiết RNA cùng với mẫu thử nhờ vậy kiểm tra được hiệu quả tách chiết RNA trên 
từng mẫu thử và phát hiện được ức chế trên các mẫu thử kết quả âm tính. Chứng âm là 
mẫu huyết thanh thật sự âm tính cũng được cung cấp kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm khi 
thao tác xét nghiệm. 
(3) Xét nghiệm và kit PCR phát hiện MTB-DNA (hình 71) dùng trong chẩn đoán 
lao dựa trên khuếch đại đoạn DNA đích 249bp trên đoạn chèn IS6110 hiện diện từ 16 
đến 30 copies trên genome 
của vi khuẩn M. tuberculosis, 
nhờ vậy độ nhạy của xét 
nghiệm có thể đạt đến mức 
phát hiện 1fg (1/10 genome vi 
khuẩn) trong thể tích mẫu thử 
cho vào ống phản ứng. Cũng 
như các xét nghiệm PCR khác, 
có chứng âm là huyết tương 
người bình thường, và có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đúng đoạn 
DNA đích nhờ vậy người làm xét nghiệm có thể kiểm chứng được được độ nhạy của 
PCR mix. Có chứng nội tại là plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng cùng mồi nhưng 
cho sản phẩm khuếch đại khác biệt DNA đích với kích thước 195bp được cung cấp ở 
lượng tối thiểu để kiểm tra được hiệu quả tách chiết DNA của kít tách chiết DNA, 
Hình 70: Kết quả xét nghiệm RT-PCR phát hiện HCV-RNA được 
thực hiện với NKHCV-RTPCR kit 
Hình 71: Kết quả xét nghiệm PCR phát hiện MTB-DNA được thực 
hiện với NKMTB-PCR kit 
 161 
chứng minh mẫu âm tính là không bị ức chế, cũng như chứng minh độ nhạy của PCR 
mix. 
(4) Xét nghiệm và kit RT-PCR phát hiện và định type virus Dengue (hình 72) hay 
sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue. Xét nghiệm và kit này cũng chứa đầy đủ các 
chứng dương, chứng nội tại đạt các chuẩn mực của xét nghiệm PCR dùng trong chẩn 
đoán như các xét nghiệm và 
kit mà chúng tôi phát triển. 
Đây là xét nghiệm và kit 
RT-PCR duy nhất hiện nay 
có khả năng vừa phát hiện 
vừa định được type virus 
Dengue chỉ qua một vòng 
PCR đa mồi mà kết quả đạt 
được luôn nhạy hơn các phương pháp dựa trên qui trình kinh điển của Lanciotti cần 
phải qua hai vòng PCR với vòng 2 làm tổ bên trong vòng 1 mới có thể định được type 
virus. Áp dụng trên thực tế lâm sàng, xét nghiệm và kít này đã chứng tỏ có khả năng 
phát hiện và định type Dengue rất sớm, ngay trong những ngày đầu của bệnh, trước khi 
có dấu hiệu giảm tiểu cầu. 
(5) Xét nghiệm và kit PCR-ELISA phát hiện và định type HPV (hình 73) trong 
các mãnh sinh thiết hay quệt 
cổ tử cung. Đây là xét 
nghiệm và kit do chúng tôi 
phát triển dựa trên nguyên 
tắc sử dụng mồi đặc hiệu 
gen L1 của virus để khuếch 
đại một đoạn DNA dài 
450bp bị đánh dấu bởi 
digoxygenine nhờ sử dụng 
PCR mix có thêm dig-dUTP. 
Sau đó định genotype của 
HPV bằng cách lai sản phẩm khuếch đại trên các giếng ELISA có các dò đặc hiệu 
Hình 72: Kết quả xét nghiệm RT-PCR phát hiện và định type virus 
Dengue gây sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue 
Hình 73: Nguyên tắc của xét nghiệm và kit NKHPV-PCR-ELISA phát 
hiện và định type HPV 
 162 
genotype gắn trên giếng qua nối hoá học streptavidine-biotin (streptavidine phủ trên 
giếng sẽ nối với các dò đặc hiệu đã gắng biotin ở đầu 5’). Sản phẩm lai “probe-sản 
phẩm khuếch đại” sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể đơn dòng đặc hiệu 
digoxygenine đánh dấu men peroxidase và tá chất TMB. Xét nghiệm và kit PCR-
ELISA này của chúng tôi có khả năng phát hiện và sau đó định được genotype của 10 
genotype thường gặp nhất của HPV là: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, và 58. Hiện xét 
nghiệm và kit này được bệnh viện Phụ Sản Từ Dũ sử dụng thành xét nghiệm dùng tầm 
soát và sàng lọc ung thư sớm cổ tư cung trên phụ nữ. 
(6) Các xét nghiệm và kit PCR để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác 
như PCR phát hiện HSV, CMV, multiplex PCR phát hiện đồng thời N. gonorrhoeae và 
C. trachomatis, L. monocytogenes, 
nonstop nested PCR phát hiện H5.... 
Tất cả đều đạt các chuẩn mực PCR 
dùng trong chẩn đoán (hình 74). 
(7) Xét nghiệm và kit real-
time PCR phát hiện và định lượng 
HBV-DNA trong huyết thanh bệnh 
nhân nhiễm HBV dựa trên PCR 
khuếch đại một đoạn đặc hiệu dài 
khỏang 190bp từ gene polymerase 
của HBV-DNA. Xét nghiệm và kit 
này đạt độ nhạy 10 copies/ml huyết 
thanh. Có chứng nội tại là plasmid 
chèn DNA tái tổ hợp sử dụng cùng 
mồi nhưng cho sản phẩm khuếch 
đại có trình tự khác biệt DNA đích 
nhờ vậy sẽ được phát hiện với dò 
taqman gắn màu huỳnh quang 
TexasRed, Hex, hay Joe khác biệt với dò taqman gắn màu FAM phát hiện sản phẩm 
khuếch đại của DNA đích. Chứng nội tại được cung cấp ở lượng tối thiểu để cho vào 
PCR mix cùng với tách chiết của mẫu thử nhờ đó kiểm tra được ức chế nếu có trên các 
Hình 74: Kết quả các xét nghiệm PCR với các kit NKHSV-PCR 
phát hiện Herpes simplex virus (trên), NKCMV-PCR 
phát hiện cytomegalo virus (giữa), và NKNGRCHL-
multiplex PCR phát hiện N. gonorrhoeae và C. 
trachomatis (dưới) 
 163 
mẫu âm tính. Có chứng âm là huyết tương người bình thường, và chứng dương chứa 
100 copies/ml plasmid chèn đúng đoạn DNA đích nhờ vậy chứng minh được độ nhạy 
của phản ứng đúng như khai báo. Các nồng độ DNA đích chuẩn cũng được cung cấp ở 
dạng bền vững nhờ vậy mà đường chuẩn luôn được xây dựng đạt R³0.990 và PCR 
efficiency luôn đạt 90-105%. 
(8) Xét nghiệm và kit RT real-time PCR phát hiện và định lượng HCV-RNA trong 
huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV dựa trên PCR khuếch đại một đoạn đặc hiệu ở 
vùng 5’-NC của genome của HCV. Xét nghiệm và kit này đạt độ nhạy 50 copies/ml 
huyết thanh. Có chứng nội tại là RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử 
dụng cùng mồi nhưng cho sản phẩm khuếch đại có trình tự khác biệt cDNA đích nhờ 
vậy sẽ được phát hiện và phân biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích với cùng 
nguyên tắc kit real-time PCR phát hiện HBV. Chứng nội tại này được cung cấp ở 
lượng tối thiểu để cho vào cùng với mẫu thử nhờ đó kiểm tra được hiệu quả tách chiết 
RNA và phát hiện được ức chế. Chứng âm là huyết tương người bình thường, và có 
chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn đúng đoạn DNA đích nhờ vậy chứng 
minh được độ nhạy của phản ứng đúng như khai báo. Các nồng độ DNA đích chuẩn 
cũng được cung cấp ở dạng 
bền vững nhờ vậy mà đường 
chuẩn luôn được xây dựng đạt 
R³0.990 và PCR efficiency 
luôn đạt 90-105% 
(9) Xét nghiệm và kit RT 
real-time PCR định lượng 
HIV1-RNA trong huyết thanh 
bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS 
dùng trong theo dõi hiệu quả 
điều trị đặc hiệu. Xét nghiệm 
dựa trên PCR khuếch đại một 
đoạn đặc hiệu ở vùng gag 
gene của genome của HIV1. Xét nghiệm và kit này đạt độ nhạy 100 copies/ml huyết 
thanh. Có chứng nội tại là RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng 
A 
B 
C 
Hình 75: Kết quả xét nghiệm định genotype HBV với kit NKHBV 
genotype-PCR (A), xét nghiệm phát hiện đột biến YMDD 
kháng lamivudine của HBV với kit NKHBVlamiR-PCR (B), 
xét nghiệm định genotype HCV với kit NKHCVinoLIPA 
genotype-core PCR (C). 
 164 
cùng mồi nhưng cho sản 
phẩm khuếch đại có trình tự 
khác biệt cDNA đích nhờ vậy 
sẽ được phát hiện và phân biệt 
với sản phẩm khuếch đại từ 
DNA đích với cùng nguyên 
tắc kit real-time PCR phát 
hiện HBV. Chứng nội tại này 
được cung cấp ở lượng tối 
thiểu để cho vào cùng với 
mẫu thử nhờ đó kiểm tra được 
hiệu quả tách chiết RNA và 
phát hiện được ức chế. Chứng 
âm là huyết tương người bình 
thường, và có chứng dương 
chứa 100 copies/ml plasmid 
chèn đúng đoạn DNA đích 
nhờ vậy chứng minh được độ 
nhạy của phản ứng đúng như 
khai báo. Các nồng độ DNA 
đích chuẩn cũng được cung 
cấp ở dạng bền vững nhờ vậy 
mà đường chuẩn luôn được 
xây dựng đạt R³0.990 và 
PCR efficiency luôn đạt 90-
105%. 
(10) Ngoài ra, để có thể cung cấp thêm giải pháp toàn diện về các xét nghiệm sinh 
học phân tử dùng trong chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan virus B và 
viêm gan virus C mạn tính, chúng tôi cũng đã phát triển các xét nghiệm và kit như: 
Nested multiplex PCR định genotype HBV, PCR-RFLP phát hiện đột biến YMDD tại 
vị trí 204 và 180 đề kháng lamivudine của HBV, PCR core kit định genotype HCV 
Hình 76: Một số các bộ xét nghiệm PCR và RT-PCR phát hiện các 
tác nhân virus gây bệnh trên tôm. Các bộ xèt nghiệm này 
đạt đầy đủ các chuẩn mực kỹ thuật cho xét nghiệm PCR 
và RT-PCR dành cho chẩn đoán 
 165 
bằng phương pháp lai với các dò trên thanh inoLIPA (hình 75). Các xét nghiệm và kit 
này hoàn toàn có thể triển khai được tại các phòng thí nghiệm có trang bị phương tiện 
PCR. 
(11) Trong lĩnh vực thủy sản, công ty Nam Khoa cũng là một công ty đầu tiên và 
hàng đầu phát triển được các bộ xét nghiệm PCR và realtime PCR phát hiện và xác 
định tỷ lệ tôm nhiễm virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, và MrNV 
với đầy đủ các chuẩn mực dành cho chẩn đoán. Công ty là nhà tiên phong trong phát 
triển phương pháp xác định tỷ lệ tôm nhiễm bệnh bằng phương pháp real-time bằng kỹ 
thuật định lượng tương đối. Hình 76 minh họa một số kit PCR và RT-PCR do công ty 
Nam Khoa phat triển để phát hiện các virus gây bệnh cho tôm. 
Và thực tế triển khai kỹ thuật các kỹ thuật sinh học phân tử khác 
Thật sự cho đến hiện nay, nhu cầu đến từ các nhà lâm sàng và nghiên cứu y học không 
chỉ đòi hỏi phải phát triển và ứng dụng các kỹ thuật PCR và real-time PCR, mà còn đòi 
hỏi các nhà khoa học phải sớm đưa các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại khác vào ứng 
dụng. Một trong các kỹ thuật mà chúng tôi nhận thấy rất cần phải thực hiện được đó là kỹ 
thuật giải trình tự. Quan điểm của chúng tôi là ứng dụng kỹ thuật này không chỉ trong 
nghiên cứu mà phải phục vụ cho chẩn đoán lâm sàng. Chính vì vậy mà trong năm 2005, 
chúng tôi đã đầu tư máy giải trình tự CEQ8000 có 3 chức năng: giải trình tự, phân tích 
đoạn, và phát hiện SNP. Năm 2007 chúng tôi đã nâng cấp thêm chức năng thực hiện 
nghiên cứu biểu hiện gen và đồng thời đầu tư thêm thiết bị giải trình tự ABI 3130XL có 
16 capillaries. Với chức năng giải trình tự, chúng tôi đã thành công trong triển khai các 
xét nghiệm: (1) Định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 
thu nhận được từ xét nghiệm định lượng HCV-RNA bằng kit NKHCV RT realtime 
TQPCR; (2) Định genotype và phát hiện các đột biến kháng lamivudine, adefovir và 
entecavir bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ gene rt của 
HBV; (3) Phát hiện đột biến precore của HBV để tiên đoán dự hậu viêm gan virus B mạn 
tính; (4) Phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicine, INH, và ethambutol trực tiếp từ 
các bệnh phẩm với kết quả chỉ trong vòng 72 giờ... Ngoài ra, các chức năng khác của 
CEQ8000 như chức năng phân tích đoạn cũng đã được chúng tôi triển khai trong xét 
nghiệm xác định quan hệ huyết thống, chức năng phát hiện SNP cũng đang được triển 
 166 
khai để phát hiện tính đa dạng loài và đột biến, chức năng biểu hiện gene trong nghiên 
cứu ung thư và hiệu quả điều trị các thuốc trị ung thư.. 
Kết luận 
Đã là một nhà khoa học, chúng ta ai cũng có những tri thức nhất định. Các tri thức này 
đến từ các sách vở hay các phương tiện tra cứu mà ngày hôm nay chúng ta rất dễ dàng 
tiếp cận. Đã là nhà nghiên cứu trong lĩnh vực y học thì chúng ta ai cũng có mong muốn 
làm được một điều gì đó từ các kiến thức mà mình đang có để có thể ứng dụng được vào 
trong giải quyết một số những thực tế đòi hỏi của chẩn đoán và nghiên cứu y học trong 
nước. Vấn đề chính yếu là làm sao để tri thức mà chúng ta có không chỉ là tri thức suông 
mà phải biến thành sản phẩm? Đây là câu hỏi mà tôi nghĩ chúng ta rất nhiều người muốn 
biết làm sao để trả lời. Chúng tôi nghĩ có 2 câu thơ của Goethe có lẽ sẽ giúp chúng ta có 
một kim chỉ nam để trả lời câu hỏi trên: 
“Knowing is not enough, we must apply 
Willing is not enough, we must do” 
Với lời phóng dịch của một người bạn của chúng tôi: 
“Tri thức sẽ chẳng bao giờ đủ 
Nếu không đem trãi nghiệm với đời 
Ước vọng cũng trở thành vô nghĩa 
Nếu cứ ngồi ôm mộng giữa chơi vơi” 
Ngoài ra, để tránh bị các nhà sản xuất nước ngoài chê bai về mặt chất lượng, chúng tôi 
cho là đừng có tự thua cuộc vì cho là TIỀN NÀO CỦA ĐÓ, mà phải trả lời bằng trau dồi 
tri thức để vươn đến các đỉnh cao khoa học vì TRI THỨC ĐẾN ĐÂU CHẤT LƯỢNG 
ĐẾN ĐÓ.