Đánh giá mồi và đoạn dò trong chẩn đoán vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (Sars-Cov-2)

SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn8
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
ĐÁNH GIÁ MỒI VÀ ĐOẠN DÒ TRONG CHẨN ĐOÁN VI RÚT 
GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP (SARS-COV-2) 
Hoàng Quốc Cường1, Nguyễn Đức Hải1, Hoàng Thùy Linh1
TÓM TẮT
Nhằm tăng khả năng sàng lọc dịch bệnh COVID-19 
tại Việt Nam, chúng tôi phân tích các mồi và đoạn dò 
trên các vùng gen E của vi rút corona được sản xuất 
trong nước (in-house) và đang lưu hành trên thị trường 
bằng kỹ thuật rRT-PCR trên 04 mẫu RNA tách chiết từ 
chủng vi rút bất hoạt đã biết trước nồng độ. Qua phân 
tích cho thấy việc phối hợp giữa mồi, đoạn dò in-house 
trong hỗn hợp introvigen có kết quả phát hiện tương 
đồng mồi đoạn dò đang được sử dụng trên thị trường. 
Việc lựa chọn một bộ xét nghiệm tối ưu là điều rất cần 
thiết trong tình trạng khan hiếm hóa chất sinh phẩm để 
chẩn đoán SARS-CoV-2 và tình hình dịch bệnh vẫn còn 
diễn biến phức tạp, đặc biệt các nước đang phát triển. 
Kết quả của nghiên cứu này là tiền đề nhằm nâng cao 
được năng lực xét nghiệm sàng lọc với số lượng lớn các 
trường hợp nghi ngờ trở về tại vùng dịch.
Từ khóa: SARS-CoV-2, COVID-19, đánh giá, mồi, 
đoạn dò. 
SUMMARY:
ASSESSMENT OF PRIMER AND PROBES FOR 
SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME 
CORONAVIRUS 2 (SARS-COV-2) DIAGNOSIS 
In order to increase the efficiency of SARS-CoV-2 
infected screening in Vietnam, we analyzed the primers 
and probes for E gene which in-house and comercially 
manufactured by rRT-PCR on 04 extracted RNA 
from inactivated virus. The analysis showed that the 
combination of primers and probes of Phu Sa in the 
Introvigen mixture resulted in a low RNA copy/reaction 
concentration. The selection of an optimal test kit is 
essential in the context of lacking reagent chemicals for 
the diagnosis of SARS-CoV-2 and the epidemic situation 
is still complicated, especially in developing countries. 
The results of this study are prerequisites for improving 
screening capacity with a large number of suspected cases 
returning from the epidemic area.
Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, evaluation, 
primer, probe.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính đến ngày 26/04/2020, đã có hơn 1.804.796 
trường hợp nhiễm vi rút gây hội chứng viêm đường hô 
hấp cấp (SARS-CoV-2) và 193.710 trường hợp tử vong 
[1]. Cho đến nay, việc chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2 
bằng xét nghiệm qRT-PCR là tiêu chuẩn vàng [2-5]; tuy 
nhiên, hiệu suất phụ thuộc vào mồi, đoạn dò và hỗn hợp 
master mix [6]. Do đó, việc lựa chọn một bộ xét nghiệm 
tối ưu là điều rất cần thiết trong tình trạng khan hiếm hóa 
chất sinh phẩm để chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2 [1, 2, 7, 
8]. Nhằm ứng phó với tình hình dịch bệnh vẫn còn diễn 
biến phức tạp đặc biệt các nước đang phát triển, chúng tôi 
phân tích các mồi và đoạn dò được sử dụng phổ biến trên 
các vùng gen E của vi rút corona bằng kỹ thuật rRT-PCR 
nhằm tăng khả năng sàng lọc dịch bệnh viêm đường hô 
hấp cấp do chủng vi rút corona mới 2019 (COVID-19) tại 
Việt Nam.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mồi và đoạn dò của IDT (Integrated DNA 
Technologies) và mồi, đoạn dò của sản xuất trong nước 
(in-house) được pha trộn trong hỗn hợp Invitrogen 
Platinum Hot Start PCR Master Mix.
2.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng xét nghiệm vi 
rút hô hấp Viện Pasteur TP.HCM, từ tháng 03/2020 đến 
tháng 04/2020.
2.3. Cỡ mẫu 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mồi và 
đoạn dò trên 4 mẫu RNA tách chiết từ chủng vi rút bất 
Ngày nhận bài: 02/04/2020 Ngày phản biện: 08/04/2020 Ngày duyệt đăng: 15/04/2020
1. Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh
Tác giả chính Hoàng Quốc Cường, Email: cuonghqpasteur@gmail.com
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn 9
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
hoạt mẫu đã biết trước nồng độ, mỗi nồng độ được lặp lại 
3 lần trong 3 ngày khác nhau.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mồi, đoạn dò 
của IDT và in-house trên các mẫu đã biết trước nồng độ theo 
phương pháp nghiên cứu đã được công bố trước đây [9].
2.4.1. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm thẩm định: 
Vi rút SARS-COV-2 được nuôi cấy trong phòng xét 
nghiệm an toàn sinh học cấp 3 tại Viện Pasteur TP.HCM. 
Sau đó, dịch nuôi cấy được bất hoạt ở nhiệt độ 65◦C trong 
vòng 1 giờ trước khi tiến hành chiết xuất RNA vi-rút với 
bộ minikit RNA vi rút QIAamp (Qiagen) theo hướng dẫn 
của nhà sản xuất [2, 5, 6]. Hỗn pha Invitrogen Platinum 
Hot Start PCR Master Mix với các trình tự Mồi của IDT 
và công ty phù sa tổng hợp theo trình tự được Tổ chức Y 
tế Thế giới công bố [2].
Thực hiện chu trình nhiệt của phản ứng theo hướng 
dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới bao gồm 04 bước sau: 
RT, hoạt hóa enzympolymerase, khuếch đại, ổn định như 
trong Bảng 2.
Bảng 1. Thành phần và thể tích cho các phản ứng rRT-PCR 
STT Thành phần Thể tích (ul)/ 1 phản ứng Số lượng phản ứng (N)
1 Nước tinh sạch 3.6 3.6xN
3 MgSO
4
 (50mM) 0.4 0.4xN
4 2X RXN mix 12.5 12.5xN
5 Mồi xuôi (F1) 1.0 1.0xN
6 Mồi ngược (R2) 1.0 1.0xN
7 Probe (P1) 0.5 0.5xN
8 Enzyme Mix 1.0 1.0xN
Tổng số 20 20xN
Bảng 2. Các bước thực hiện phản ứng rRT-PCR. 
Bước Số chu kỳ Thời gian
RT 1 55oC trong 10 phút
Hoạt hóa enzympolymerase 1 94oC trong 03 phút
Khuếch đại 45
94oC trong 15 giây
58oC trong 30 giây (thu nhận tín hiệu huỳnh quang)
Ổn định 1 40oC trong 30 giây
Cách đọc kết quả: 
Kết quả xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống 
Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR đã 
được hiệu chuẩn định kỳ tại Viện Pasteur TP.HCM. Mẫu 
dương được định nghĩa dương tính khi tín hiệu huỳnh 
quang được thu nhận trước chu kỳ thứ 40 của phản ứng, 
và tín hiệu phải rõ ràng. 
2.4.2. Xử lý và phân tích số liệu: Dữ liệu được 
nhập vào phần mềm Epidata và dùng phần mềm Stata 
13.0 để xử lý và phân tích. Tần số (tỷ lệ) được sử dụng 
trong biến số định tính, trung bình±độ lệch chuẩn (trung 
vị- tứ phân vị), độ lệch chuẩn tương đối cho biến số định 
lượng, sử dụng mô hình quy tuyến tính để ước tính chỉ 
số R2. 
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn10
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
Bảng 3. Kết quả so sánh giữa mồi, đoạn dò giữa IDT và in-house trong hỗn hợp master mix Introvigen 
Nồng độ pha 
loãng từ chủng
Số copy RNA/ 
phản ứng
IDT(ngưỡng chu kỳ) In-house(ngưỡng chu kỳ)
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
1:108 187
36.85 37.91 35.33 34.34 35,31 36.51
36.45 37.94 34.34 35.43 35,87 36.62
35.57 34.82 34.21 36.24 34.62 34.60
1:108 ½ 73
37.23 36.12 35.57 35.59 36.01 38.4
37.29 37.46 35.29 35.16 37.71 36.32
38.29 36.64 38.27 39.29 38.86 37.44
1:109 29
36.84 37.74 37.18 36.86 39,85 38.30
37.32 38.42 37.43 37.70 38,42 39.07
38.91 36.20 38.21 38.94 38,67 38.65
1:109 ½ 15
38.85 38.55 39.84 38.13 39,90 39.30
38.76 38,25 - 38.18 - 38.62
- - - -
Chứng âm - - - - - -
Chứng dương 28.40 28.38 26.72 20.81 30.56 29.39
Qua phân tích cho thấy, primer-probe in-house và 
IDT trong hỗn hợp introvigen có ngưỡng phát hiện 15 bản 
sao RNA/phản ứng, với R2 lần lượt là 0.95 và 0.99, độ 
lệch chuẩn tương đối <15%.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu: Nghiên cứu được 
thông qua bởi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh 
học của Viện Pasteur TP.HCM số 433/XN-PAS ngày 11 
tháng 03 năm 2020.
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả đánh mồi, đoạn dò trong hỗn hợp 
master mix Introvigen
Kết quả phân tích cho thấy, hỗn hợp mồi, đoạn dò của 
IDT trong hỗn hợp master mix Introvigen phát hiện được 
ở ngưỡng 29 copy/phản ứng với tỷ lệ 9/9 (100%) lần lặp 
lại. Trong khi đó, mồi và đoạn dò in-house với cùng hỗn 
hợp introvigen ngưỡng phát hiện RNA/phản ứng cũng có 
kết quả tương tự. 
Với nồng độ pha loãng 10-9 ½, nồng độ pha loãng 
thấp nhất, từ chủng SARS-CoV-2, hỗn hợp Introvigen + 
mồi + đoạn dò in-house và IDT, hỗn hợp này có thể ghi 
nhận được tín hiệu với tỷ lệ 5/9 lần lặp lại. 
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn 11
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Bảng 4. Các tiêu chí đánh giá mồi, đoạn dò giữa IDT và in-house trong hỗn hợp Introvigen
Nồng 
độ pha 
loãng từ 
chủng
Số 
copy 
RNA/ 
phản 
ứng
IDT
(Ngưỡng chu kỳ)
In-house
(ngưỡng chu kỳ)
TB ĐLC
ĐLC
tương 
đối (%)
ĐLC
tương đối 
yêu cầu
R2 TB ĐLC
ĐLC
tương 
đối (%)
ĐLC
tương đối 
yêu cầu
R2
1:108 187 35.94 1.43 3.97
<15% 0.99
35.48 0.98 2.76
<15% 0.95
1:108 ½ 73 36.91 1.09 2.94 37.20 1.49 4.01
1:109 29 37.58 0.84 2.23 38.25 0.84 2.20
1:109 ½ 15 38.25 1.40 3.65 38.56 0.54 1.41
*ĐLC: Độ lệch chuẩn
V. BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mồi, đoạn 
dò nhằm đưa ra chiến lược lựa chọn sinh phẩm tối ưu nhất 
phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh COVID-19 
tại Việt Nam. Qua đánh giá ban đầu cho thấy sự phối hợp 
giữa mồi, đoạn dò in-house có kết quả khá tương đồng so 
với IDT, với độ lệch chuẩn tương đối<15% thỏa yêu cầu 
trong đánh giá sinh phẩm chẩn đoán trước đây [10-12]. 
Kết quả này phần nào giúp cho các cơ sở y tế nâng 
cao khả năng sàng lọc, chủ động trong việc sử dụng mồi 
và đoạn dò được các ca bệnh COVID-19 với ngưỡng phát 
hiện thấp từ đó đề xuất giải pháp cho ban chỉ huy phòng 
chống dịch để có chiến lược hiệu quả. Nghiên cứu của Yu 
và cộng sự cho thấy mồi và đoạn dò ‘2019-nCoV_N2, 
N3, của Hoa Kỳ và ‘ORF1ab của Trung Quốc là các mồi 
và đoạn dò mồi nhạy nhất cho các gen N và Orf1. Do 
đó, sự kết hợp phù hợp từ ORF1ab (Trung Quốc), 2019- 
nCoV_N2, N3 (Hoa Kỳ) và NIID_2019-nCOV_N (Nhật 
Bản) là bộ sinh phẩm tối ưu để chẩn đoán xác định SARS-
CoV-2[13]. Nghiên cứu của Mario và cộng sự cho thấy 
máy cobas là một xét nghiệm đáng tin cậy để phát hiện 
SARS-CoV-2 trong các mẫu bệnh phẩm mũi họng được 
thu thập trong hệ thống trung chuyển toàn cầu (UTM-RT) 
[6]. Qua đây cho thấy, chiến lược sàng lọc và chẩn đoán 
xác định SARS-CoV-2 phụ thuộc vào từng chiến lược của 
từng quốc gia, tuy nhiên, tất cả đều hướng đến việc lựa 
chọn sinh phẩm tối ưu nhất nhằm phòng chống dịch bệnh 
hiệu quả.
Trong bối cảnh, giao thương đi lại ngày càng tăng 
do một số lượng lớn các hành khách từ các vùng dịch 
trở về nước, tình hình diễn tiến dịch do COVID-19 và số 
người tử vong sẽ tiếp tục tăng nhanh trong thời gian sắp 
tới là điều khó tránh khỏi, việc lựa chọn sinh phẩm tối ưu 
nhất để có kết quả sàng lọc được nhiều trường hợp mắc 
nhiễm SARS-CoV-2 phục vụ cho công tác phòng chống 
dịch Covid-19 và các bệnh truyền nhiễm khác là việc làm 
cấp bách [14]. Tính đến thời điểm hiện nay, đây là nghiên 
cứu đầu tiên về đánh giá mồi, đoạn dò cho xét nghiệm 
chẩn đoán vi rút SARS-CoV-2 tại Việt Nam. Kết quả của 
nghiên cứu này là tiền đề nhằm nâng cao được năng lực 
xét nghiệm sàng lọc với số lượng lớn các trường hợp nghi 
ngờ trở về tại vùng dịch với ngưỡng phát hiện thấp.
V. KẾT LUẬN
Kết quả phối hợp giữa mồi, đoạn dò in-house trong 
hỗn hợp introvigen có kết quả phát hiện tương đồng mồi 
đoạn dò đang được sử dụng trên thị trường. Việc lựa chọn 
một bộ xét nghiệm tối ưu là điều rất cần thiết trong tình 
trạng khan hiếm hóa chất sinh phẩm để chẩn đoán SARS-
CoV-2 và tình hình dịch bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp, 
đặc biệt các nước đang phát triển. Kết quả của nghiên cứu 
này là tiền đề nhằm nâng cao được năng lực xét nghiệm 
sàng lọc với số lượng lớn các trường hợp nghi ngờ trở về 
tại vùng dịch.
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn12
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Organization, W.H. Coronavirus disease 2019 (COVID-19): situation report, 97. 2020 Accessed on 28.04.2020]; 
Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports.
2. Corman, V.M., et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance, 
2020. 25(3).
3. Hadjinicolaou, A.V., et al., Development of a molecular-beacon-based multi-allelic real-time RT-PCR assay for 
the detection of human coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV): a general methodology 
for detecting rapidly mutating viruses. Archives of virology, 2011. 156(4): p. 671-680.
4. Lin, C., R. Ye, and Y. Xia, A meta-analysis to evaluate the effectiveness of real-time PCR for diagnosing novel 
coronavirus infections. Genet Mol Res, 2015. 14: p. 15634-15641.
5. Organization, W.H., Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (COVID-19) in suspected human cases: 
interim guidance, 2 March 2020. 2020, World Health Organization.
6. Casto, A.M., et al., Comparative Performance of SARS-CoV-2 Detection Assays using Seven Different Primer/
Probe Sets and One Assay Kit. medRxiv, 2020.
7. Konrad, R., et al., Rapid establishment of laboratory diagnostics for the novel coronavirus SARS-CoV-2 in 
Bavaria, Germany, February 2020. Eurosurveillance, 2020. 25(9).
8. Al-Abdallat, M.M., et al., Hospital-associated outbreak of Middle East respiratory syndrome coronavirus: a 
serologic, epidemiologic, and clinical description. Clinical Infectious Diseases, 2014. 59(9): p. 1225-1233.
9. Lan, P.T., et al., Development of standardized specimens with known concentrations for severe acute respiratory 
syndrome coronavirus 2 Realtime-RT-PCR testing validation. Bull World Health Organ. E-pub: 20 April 2020, 2020.
10. Rabenau, H.F., et al., Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical virology. Journal of 
clinical virology, 2007. 40(2): p. 93-98.
11. Use, C.f.M.P.f.H., Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency, 2011.
12. HHS-FDA, C., CVM. Guidance for industry: bioanalytical method validation. Rockville, 2018.
13. Jung, Y.J., et al., Comparative analysis of primer-probe sets for the laboratory confirmation of SARS-CoV-2. 
BioRxiv, 2020.
14. Toms, D., J. Li, and H.Y. Cai, Evaluation of WHO listed COVID-19 qPCR primers and probe in silico with 
375 SERS-CoV-2 full genome sequences. medRxiv, 2020.