Đánh giá chứng dương, mồi và mẫu dò cho chẩn đoán vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (Sars-Cov-2)

SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn 3
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐÁNH GIÁ CHỨNG DƯƠNG, MỒI VÀ MẪU DÒ CHO CHẨN 
ĐOÁN VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP 
CẤP (SARS-COV-2) 
Hoàng Quốc Cường1, Nguyễn Thị Thanh Thảo1, Phan Trọng Lân1
TÓM TẮT
Đánh giá chứng dương, mồi, đoạn dò cho xét nghiệm 
chẩn đoán vi rút SARS-CoV-2 trong bối cảnh thiếu hụt 
sinh phẩm chẩn đoán và tình hình dịch bệnh viêm đường 
hô hấp cấp đang có xu hướng diễn tiến phức tạp là việc 
làm hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi 
đánh giá chứng dương, mồi và mẫu dò chẩn đoán vi rút 
SARS-CoV-2 trên 60 mẫu ngoáy họng. Qua phân tích cho 
thấy, chứng dương, mồi và đoạn dò thỏa các tiêu chí của 
thế giới với 100% các chuỗi SARS-CoV-2, các mẫu dương 
có kết quả dương tính ở các nồng độ khác nhau, không ghi 
nhận phản ứng chéo. Kết quả này phần nào có thể hỗ trợ 
sàng lọc ca bệnh trong ngày, trong từng thời điểm báo cáo 
nhanh cho ban chỉ huy phòng chống dịch để có chiến lược 
hiệu quả. Nghiên cứu này là tiền đề giúp giải quyết những 
lo ngại về sức khỏe cộng đồng khẩn cấp này bằng cách 
sàng lọc với số lượng lớn các trường hợp nghi ngờ trở về 
tại vùng dịch, cũng như đáp ứng khả năng xét nghiệm sẵn 
có trong các phòng thí nghiệm tại cơ sở y tế ở Việt Nam.
Từ khóa: SARS-CoV-2, COVID-19, chứng dương, 
mồi, đoạn dò.
SUMMARY:
RESEARCH ON POSITIVE CONTROL, 
PRIMER, PROBES FOR SEVERE ACUTE 
RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 
(SARS-COV-2) DIAGNOSIS
In order to evaluate positive control, primer, 
and probes for SARS-CoV-2 diagnostic in the context 
of diagnostic biologic deficiency and pandemic 
situationsituation is essential. Evaluation of positive 
signs, primers and diagnostic samples of SARS-CoV-2 
virus on 60 throat samples. The positive control, primer, 
and probes met the international criteria with 100% of the 
SARS-CoV-2 sequences, contrived clinical specimens had 
SARS-CoV-2 positive at different concentrations, no cross-
reactivity was recorded. This result can partly support 
screening suspected cases on the day, from time to time 
to quickly report to the prevention and control committee 
for an effective strategy. This study is a prerequisite 
for addressing these urgent public health concerns by 
screening a large number of suspected return cases in the 
epidemic area, as well as to adapt to the available testing 
capacity in laboratories at health facilities in Vietnam.
Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, positive 
control, primer, probe.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại dịch viêm đường hô hấp cấp do chủng vi rút 
corona mới được phát hiện lần đầu tiên tại thành phố Vũ 
Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc, virut này có tên là SAR 
SARS-CoV-2 và bệnh mà nó gây ra đã được đặt tên là bệnh 
coronavirus 2019 (COVID-19) [1]. SARS-CoV-2 đã lây 
lan nhanh chóng trên toàn cầu, dẫn đến những tác động 
đáng kể đến các hệ thống chăm sóc sức khỏe và gây ra sự 
gián đoạn xã hội [2]. Nguy cơ sức khỏe cộng đồng tiềm ẩn 
do COVID-19 gây ra là rất cao. Để đáp ứng hiệu quả với 
sự bùng phát COVID-19, việc phát hiện nhanh các trường 
hợp và tiếp xúc gần, điều trị lâm sàng và kiểm soát nhiễm 
trùng thích hợp và thực hiện các nỗ lực giảm thiểu cộng 
đồng là rất quan trọng [1, 3-8]. 
Cho đến nay, chẩn đoán xác định vi rút SARS-CoV-2 
bằng xét nghiệm qRT-PCR là tiêu chuẩn vàng [9]; tuy 
nhiên, hiệu suất của xét nghiệm này lại phụ thuộc vào 
mồi, đầu dò và thuốc thử. Do đó, việc lựa chọn một bộ xét 
nghiệm tối ưu là cần thiết trong tình trạng thiếu hóa chất 
sinh phẩm để chẩn đoán SARS-COV-2 và sự gia tăng của 
các trường hợp mắc mới SARS-COV-2, đặc biệt trong các 
Ngày nhận bài: 02/04/2020 Ngày phản biện: 09/04/2020 Ngày duyệt đăng: 14/04/2020
1. Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh
Tác giả chính Hoàng Quốc Cường, Email: cuonghqpasteur@gmail.com
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn4
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
nước đang phát triển. Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu 
chế tạo chứng dương, mồi và đoạn đò dựa trên các công 
bố trước đây phục vụ việc sàng lọc kịp thời các trưởng 
hợp nhiễm vi rút SARS-CoV-2.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chứng dương, mồi và mẫu dò chẩn đoán SARS-COV-2.
2.2. Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu: 
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng xét nghiệm vi rút hô hấp 
Viện Pasteur TP.HCM, từ tháng 02/2020 đến tháng 04/2020.
2.3. Cỡ mẫu: 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu thập 60 mẫu 
ngoáy họng bao gồm 30 mẫu âm và 30 mẫu dương tính 
giả lập từ các bệnh nhân lâm sàng.
2.4. Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá chứng 
dương, mồi và mẫu dò trong chẩn đoán vi rút SARS-
COV-2.
2.4.1. Chọn mồi: Dựa trên trình tự Primer do Tổ chức 
Y tế Thế giới (WHO) và US CDC công bố [9], chúng tôi 
chọn đoạn mồi và mẫu dò trong chẩn đoán nhanh virus 
SARS-CoV-2. 
Bảng 1. Trình tự gen mồi của gen E của SARS-CoV-2 được sử dụng.
Tên trình tự Trình tự (5’-3’) Sản phẩm Vị trí Trình tự tham chiếu
nCoV_E_Fw CCGACGACGACTACTAGC
280 bp
26191-26208
MN908947
nCoV_E_Rv AGACCAGAAGATCAGGAACTC 26470-26450
2.4.2. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm thẩm định: Thu 
thập 60 mẫu bệnh phẩm ngoáy họng từ các bệnh nhân (mã 
số bệnh phẩm, giới, tuổi, loại mẫu bệnh phẩm, ngày thu 
thập mẫu, ngày nhận mẫu), sau đó thực hiện phản ứng 
rRT-PCR để xác định mẫu bệnh phẩm có kết quả chắc 
chắn âm tính và chia thành 2 lô, mỗi lô 30 mẫu. 
Vi rút SARS-COV-2 được nuôi cấy trong phòng xét 
nghiệm an toàn sinh học cấp 3 tại Viện Pasteur TP.HCM 
và tạo các mẫu mẫu dương giả lập. Các mẫu lâm sàng ở 2 
lô tiến hành chiết xuất RNA vi-rút với bộ minikit RNA vi 
rút QIAamp (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, 
pha mix với Kit SuperScript III Platinium One Step qRT-
PCR. Trình tự Mồi (xuôi và ngược) và Dual – labeled 
probes tổng hợp theo trình tự được Tổ chức Y tế Thế giới 
công bố [9].
Thực hiện phản ứng rRT-PCR: Trong nghiên cứu 
này để phát hiện gen E của SARS-COV-2, sinh phẩm chẩn 
đoán được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khi trộn 
sinh phẩm dùng pipet trộn nhẹ nhàng, không dùng máy 
lắc. Chia 20 ul mỗi loại phản ứng sau khi trộn vào các 
ống. Ở cột chứng âm cho 5ul nước tinh sạch và đậy nắp 
trước khi chuyển sang nơi cho bệnh phẩm. Cho 5 ul RNA 
mẫu vào ống đã được chia sinh phẩm tại nơi cho mẫu. Cho 
RNA chứng dương: Cho 5ul RNA chứng mỗi loại, trộn 
đều, đóng nắp, lắc (khoảng 5 giây) và ly tâm (khoảng 5 
giây), rồi giữ trong giá tích lạnh.
Cách đọc kết quả: 
Kết quả xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống 
rRT-PCR: Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-
Time PCR đã được hiệu chuẩn định kỳ tại Viện Pasteur 
TP.HCM. Chứng âm sẽ không có tín hiệu huỳnh quang. 
Mẫu được coi là dương tính khi tín hiệu huỳnh quang 
được thu nhận trước chu kỳ thứ 40 của phản ứng, và tín 
hiệu phải rõ ràng. 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi ước tính nồng độ 
copy/µL trong các mẫu lâm sàng dựa trên đường chuẩn đã 
được công bố trong nghiên cứu trước đây [10].
2.2.3. Xử lý và phân tích số liệu: Dữ liệu được nhập 
vào phần mềm Epidata và dùng phần mềm Stata 13.0 để 
xử lý và phân tích. Tần số (tỷ lệ) được sử dụng đối với 
biến số định tính, trung bình±độ lệch chuẩn (trung vị- tứ 
phân vị) đối với biến số định lượng.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu: Nghiên cứu được 
thông qua bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh 
học của Viện Pasteur TP.HCM số 433/XN-PAS ngày 11 
tháng 03 năm 2020.
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả đánh thử nghiệm chứng dương, mồi, 
đoạn dò.
Qua đánh giá lâm sàng kết quả cho thấy, 100% mẫu 
dương có nồng độ 1 LoD và 2 LoD với ngưỡng trung 
bình lần lượt là 16 và 42 copy/phản ứng. Bên cạnh đó, 
100% mẫu dương ở tất cả các nồng độ khác (3x-5x LoD) 
có kết quả dương tính và 100% mẫu âm tính có kết quả 
âm tính. 
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn 5
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
STT Mã số bệnh 
nhân
Nồng độ pha 
loãng 
LoD Giá trị CT Log 
copy/ul
Copy
Copy/phản 
ứng (5uL)
1 CL-20573 10^-9
1x LoD
38.89 0.307 2.028 10
2 CL-20576 10^-9 37.82 0.598 3.961 20
3 CL-20-581 10^-9 37.3 0.739 5.484 27
4 CL-20569 10^-9 38.36 0.451 2.825 14
5 CL-20575 10^-9 38.94 0.022 1.051 10
6 CL-20577 10^-8 ½ 
2xLoD
37.65 0.644 4.406 22
7 CL-20582 10^-8 ½ 36.54 0.946 8.824 44
8 CL-20589 10^-8 ½ 36.55 0.943 8.769 44
9 CL20571 10^-8 ½ 37.43 0.704 5.056 25
10 CL20565 10^-8 ½ 38.99 0.280 1.905 10
11 CL-20554 10^-8 ½ 36.91 0.845 7.000 35
12 CL-20588 10^-8 ½ 34.83 1.410 25.723 129
13 CL-20594 10^-8 ½ 37.99 0.552 3.561 18
14 CL-20586 10^-8 ½ 37.57 0.666 4.632 23
15 CL-20543 10^-8 ½ 37.89 0.579 3.791 19
16 CL-20587 10^-8 ½ 38.47 0.421 2.638 13
17 CL-20579 10^-8 ½ 35.59 1.204 15.988 80
18 CL-20557 10^-8 ½ 37.00 0.821 6.617 33
19 CL-20570 10^-8 ½ 35.89 1.122 13.252 66
20 CL-20544 10^-8 ½ 35.81 1.144 13.932 70
21 CL-20583 10^-4
5 x LoD
27.14 3.500 3162.278 15811
22 CL-20547 10^-4 28.82 3.043 1105.295 5526
23 CL-20590 10^-4 29.67 2.813 649.382 3247
24 CL-20565 10^-5
4 x LoD
31.69 2.264 183.479 917
25 CL-20578 10^-5 32.23 2.117 130.872 654
26 CL-20558 10^-5 31.95 2.193 155.932 780
27 CL-20556 10^-5 32.3 2.098 125.264 626
28 CL-20555 10^-6
3 x LoD
37.14 0.783 6.062 30
29 CL-20564 10^-6 34.68 1.451 28.254 141
30 CL-20614 10^-6 36.95 0.834 6.827 34
31
Chứng dương 
WHO
 36.52 0.951 8.935 45
32 Chứng dương 
nghiên cứu
 26.43 + + +
33 Chứng âm - - -
“-”: Không phát hiện
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn6
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
3.2. Tính toàn bộ:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi PCR phân tích 
silico trình tự mồi, đầu dò và chứng dương trong nghiên 
cứu và các trình tự SARS-CoV-2 được công bố trước 
đây [9].
Trình tự gen E
CCGACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTC 
GTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTT 
GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGT 
GAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCT 
GATCTTCTGGTCT
E gene
Forward primer
Reverse primer
NC_045512 COVID-19/Wuhan-Hu-1 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
MT039888 COVID-19/2019-nCoV/USA 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
MN994467 COVID-19/2019-nCoV/USA 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
LC522975 COVID-19/2019-nCoV/Jap 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
MN988668 COVID-19/2019-nCoV WHU 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
NC_004718 SARS coronavirus 
CCGACGACGACTACTAGC----- - - - - - - - - - - -
GAGTTCCTGATCTTCTGGTCT
NC_006213 Human coronavirus OC43 
C.G..--...CT......----------------...T.......C..C.G..CT
NC_005831 Human coronavirus NL63 ..
G.CGA.GA........----------------...T.....A.CT...G..CT
NC_002645 Human coronavirus 229E .....
GA..AC.......----------------...TT.C.........G.T.T
NC_019843 MERS coronavirus 
C.......G.CTA.T...----------------...TT.C.........G.T.T
*Những nu khác biệt giữa các trình tự được thay 
thể bằng dấu (.) và những trình tự không nằm trong vùng 
primer bắt cặp được thay thể bằng dầu (-).
Những trình tự đã được xác định là SASR-CoV-2:
NC_045512 COVID-19/Wuhan-Hu-1
MT039888 COVID-19 isolate 2019-nCoV/USA-
MA1/2020
MN994467 COVID-19 isolate 2019-nCoV/USA-
CA1/2020 
LC522975 COVID-19 isolate 2019-nCoV/Japan/
TY/WK-521/2020 RNA
MN988668 COVID-19 isolate 2019-nCoV WHU01
Kết quả phân tích silico cho thấy, 100% các chuỗi 
SARS-CoV-2 chứng dương và đoạn mồi trong nghiên cứu 
phù hợp với các mồi và đầu dò được thẩm định.
3.3. Phản ứng chéo:
Những trình tự có mối quan hệ gần gữi không phải 
WUHAN coronavirus (COVID-19):
NC_004718 SARS coronavirus 
NC_005831 Human coronavirus NL63 
NC_002645 Human coronavirus 229E 
NC_019843 MERS coronavirus 
NC_006577 Human coronavirus HKU1 
NC_006213 Human coronavirus OC43
Từ các trình tự đã tổng hợp như đã mô tả ở mục 
3.3, kết quả phân tích silico chứng dương và đoạn mồi 
trong nghiên cứu nhỏ hơn 80% giữa một trong những các 
mồi/đầu dò và bất kỳ trình tự nào được khuyến cáo như: 
HCoV-HKU1; HCoV-OC43; HCoV-NL63; HCoV-229E; 
MERS-CoV; Influenza A (H1N1/09); Influenza; A (H3N2); 
Influenza A(H5N1); Influenza B; Rhinovirus/Enterovirus; 
Respiratory syncytial vi rút (A/B); Parainfluenza 1 
vi rút; Parainfluenza 2 vi rút; Parainfluenza 3 vi rút; 
Parainfluenza A or -B vi rút; Human metapneumovirus; 
Adenovirus; Human Bocavirus; Legionella spp; 
Mycoplasma spp.
IV. BÀN LUẬN
Ngoài tác động kinh tế và y tế mà đại dịch COVID-19 
đã gây ra, sự thiếu hụt về thiết bị bảo vệ cá nhân và thiết bị 
y tế (máy thở) cũng như thiết bị lấy mẫu, thuốc thử, vật tư 
tiêu hao và dụng cụ chẩn đoán kịp thời nhiễm vi rút SARS-
SỐ 3 (56) - Tháng 05-06/2020
Website: yhoccongdong.vn 7
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bermingham, A., et al., Severe respiratory illness caused by a novel coronavirus, in a patient transferred to 
the United Kingdom from the Middle East, September 2012. Eurosurveillance, 2012. 17(40): p. 20290.
2. Li, J.-Y., et al., The epidemic of 2019-novel-coronavirus (2019-nCoV) pneumonia and insights for emerging 
infectious diseases in the future. Microbes and Infection, 2020. 22(2): p. 80-85.
3. Al-Abdallat, M.M., et al., Hospital-associated outbreak of Middle East respiratory syndrome coronavirus: a 
serologic, epidemiologic, and clinical description. Clinical Infectious Diseases, 2014. 59(9): p. 1225-1233.
4. Josset, L., et al., Cell host response to infection with novel human coronavirus EMC predicts potential 
antivirals and important differences with SARS coronavirus. MBio, 2013. 4(3): p. e00165-13.
5. Lin, C., R. Ye, and Y. Xia, A meta-analysis to evaluate the effectiveness of real-time PCR for diagnosing novel 
coronavirus infections. Genet Mol Res, 2015. 14: p. 15634-15641.
6. Organization, W.H. Coronavirus disease 2019 (COVID-19): situation report, 97. 2020 Accessed on 
28.04.2020]; Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports.
7. Reusken, C.B., et al., Laboratory readiness and response for novel coronavirus (2019-nCoV) in expert 
laboratories in 30 EU/EEA countries, January 2020. Eurosurveillance, 2020. 25(6).
8. Sims, A.C., et al., Release of severe acute respiratory syndrome coronavirus nuclear import block enhances 
host transcription in human lung cells. Journal of virology, 2013. 87(7): p. 3885-3902.
9. Corman, V.M., et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance, 
2020. 25(3).
10. Lan, P.T., et al., Development of standardized specimens with known concentrations for severe acute 
respiratory syndrome coronavirus 2 Realtime-RT-PCR testing validation. Bull World Health Organ. E-pub: 20 April 
2020, 2020.
11. Food, U. and D. Administration. Policy for Diagnostic Tests for Coronavirus Disease-2019 During the Public 
Health Emergency: Immediately in Effect Guidance for Clinical Laboratories, Commercial Manufacturers, and Food 
and Drug Administration Staff. in United States. Food and Drug Administration. 2020. United States. Food and Drug 
Administration.
CoV-2 cũng đang xảy ra trên quy mô toàn cầu, đặc biệt đối 
với các nước đang phát triển. Vì thế việc đánh giá các sinh 
phẩm chẩn đoán SARS-CoV-2 được sản xuất trong nước 
là công viêc cấp bách trong công tác phòng chống dịch 
bệnh COVID-19. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh 
giá chứng dương, mồi, đoạn dò với kết quả ban đầu cho 
thấy bộ sinh phẩm chẩn đoán trong nghiên cứu chúng tôi 
đáp ứng tất cả các tiêu chí của trên thế giới [7, 11]. Kết 
quả này phần nào có thể hỗ trợ sàng lọc ca bệnh trong 
ngày, trong từng thời điểm, nhằm báo cáo nhanh cho ban 
chỉ huy phòng chống dịch để có chiến lược đối phó với 
tình hình dịch bệnh một cách có hiệu quả. Với diễn tiến 
lan truyền dịch do COVID-19 và số người chết tiếp tục 
tăng nhanh trong thời gian gần với quy mô toàn cầu, việc 
khuyến khích và thúc đẩy sản xuất, cung cấp và đánh giá 
chứng dương-mồi, đoạn dò là việc là hết sức cần thiết 
những phục vụ cho công tác phòng chống dịch Covid-19. 
Tính đến thời điểm hiện tại, đây là nghiên cứu đầu tiên về 
đánh giá chứng dương, mồi, đoạn dò cho xét nghiệm chẩn 
đoán vi rút SARS-CoV-2.
Nghiên cứu này là tiền đề giúp giải quyết những lo 
ngại về sức khỏe cộng đồng khẩn cấp này bằng cách sàng 
lọc với số lượng lớn các trường hợp nghi ngờ trở về tại 
vùng dịch, cũng như đáp ứng khả năng xét nghiệm sẵn 
có trong các phòng thí nghiệm tại cơ sở y tế ở Việt Nam.
V. KẾT LUẬN
Qua phân tích cho thấy, chứng dương, mồi và đoạn 
dò trong nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chí của thế giới 
với 100% các chuỗi SARS-CoV-2, các mẫu dương có kết 
quả dương tính ở các nồng độ khác nhau, không ghi nhận 
phản ứng chéo.