Bài giảng Miễn dịch học thú y - Chương 6: Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể

(Veterinary Immunology)
CHƢƠNG 6
PHẢN ỨNG GIỮA KHÁNG NGUYÊN 
VÀ KHÁNG THỂ
1) Sự kết hợp giữa kháng nguyên và khángthể
 Khi cho KT đặc hiệu tiếp xúc với KN đã kích thích sinh ra
chúng thi phản ứng kết hợp KN + KT sẽ xảy ra một cách đặc
hiệu
 Phản ứng kết hợp này có thể xảy ra trong cơ thể động vật hay
trong ống nghiệm.
 KT dịch thể đặc hiệu thường tồn tại trong huyết thanh và chất
dịch của cơ thể, nên phản ứng kết hợp giua KN + KT dịch thể
gọi là phản ứng huyết thanh học.
 Phương pháp chẩn đoán dựa vào phản ứng huyết thanh học
gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Phương pháp
này thường được thực hiện trong phòng thí nghiệm hay trên
cơ thể động vật.
 Việc dùng phản ứng kết hợp giưa KN + KT đặc hiệu cho
phép ta xác định 1 KN chưa biết bằng 1 KT đã biết hoặc
ngược lại.
2) Phản ứng huyết thanh học
 Khi KN tiếp xúc với KT dịch thể đặc hiệu tương ứng thì
phản ứng kết hợp giưa KN +KT sẽ xảy ra một cách đặc hiệu.
 Cụ thể Epitop sẽ kết hợp chính xác với Paratop của kháng
thể.
 Sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể phải được thực
hiện trong một điều kiện nhất định: nhiệt độ, pH thích hợp và
môi trường có chất điện giải
 Các phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được chia
làm hai nhóm:
1- Những phản ứng có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường
2-Những phản ứng phải dùng kỹ thuật đánh dấu để phát hiện
PHẢN ỨNG 
GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ
PHẢN ỨNG 
GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ
CÁC PHẢN ỨNG HUYẾT THANH HỌC CÓ THỂ QUAN SÁT 
BẰNG MẮT THƢỜNG
(1). Phản ứng ngƣng kết (Agglutination Test)
a). Phản ứng ngưng kết trực tiếp
* Nguyên lý
• Đối với kháng nguyên hữu hình (xác vi khuẩn, tế bào hồng
cầu...) khi gặp kháng thể đặc hiệu, vi khuẩn sẽ kết lại với nhau
thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được.
• Sự ngưng kết kháng nguyên - kháng thể dưới hình thức mạng
lưới nhiều chiều, tạo nên đám ngưng kết, biểu hiện của nó bằng
những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát.
• Với lớp kháng thể IgM, phản ứng ngưng kết dễ xảy ra hơn vi
nó có 10 vị trí kết hợp với kháng nguyên, IgG chỉ có 2 vị trí.
CÁC LỚP GLOBULIN MIỄN DỊCH
Phản ứng giữa KN và KT
Các loại phản ứng ngƣng kết
 Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
• Đây là phản ứng có tính chất định tính. Thường sử dụng kháng
nguyên đã biết được nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương
ứng trong huyết thanh. Thường dùng để chẩn đoán bệnh truyền
nhiễm.
• Ví dụ: - Bệnh thương hàn gà Typhus avium
- CRD (Chronic Respiratory Disease)
• Cách làm:
• Dùng một phiến kính, một bên thí nghiệm, một bên đối chứng.
• Bên thí nghiệm nhỏ 1 giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ
1 giọt kháng nguyên đã biết trộn đều, sau 1 - 2 phút đọc kết
quả.
• Nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng kháng nguyên +
kháng thể tạo thành đám ngưng kết.
Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
HT
KN
Nƣớc sinh lý
- +
 Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm
• Phản ứng vừa có tính chất định tính, vừa có thể định lượng kháng thể
• Cách làm:
• Trộn đều để ở nhiệt độ thích hợp (tủ ấm 370C) sau 30 phút hoặc vài
giờ, đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết
• Hiệu giá ngƣng kết: Là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở
đó vẫn còn khả năng gây hiện tượng ngưng kết.
• Phản ứng này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh sảy thai
truyền nhiễm (BRUCELLOSIS) do vi khuẩn Brucella suis.
b). Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
• Trong phản ứng ngưng kết khi dùng kháng nguyên hoà tan để phát
hiện một kháng thể tương ứng. Phải cần đến tế bào làm giá đỡ
mang các phân tử kháng nguyên hoà tan.
• Thường dùng hồng cầu làm tế bào mang.
Nguyên lý:
• Kháng nguyên hoà tan trở thành kháng nguyên hữu hình bằng cách
gắn kháng nguyên hoà tan vào hồng cầu, như vậy hồng cầu làm
giá đỡ cho kháng nguyên.
• Phản ứng ngưng kết dễ dàng xảy ra.
• Có nhiều phương pháp gắn kháng nguyên hoà tan lên bề mặt hồng
cầu: Dùng một số hoá chất như axit tanic, benzidin, muối crôm,
glutaldehyt để xử lý hồng cầu. Các chất này có một nhóm chức
gắn với hồng cầu, một nhóm gắn với kháng nguyên.
• Khi kháng nguyên gặp kháng thể tương ứng, phản ứng
ngưng kết xảy ra, ta quan sát rõ.
• Ngoài sử dụng hồng cầu làm giá đỡ, còn sử dụng các hạt
chất dẻo như: hạt latex, bentonít. Các hạt này có tác dụng
hấp phụ kháng nguyên hoà tan vào trong đó.
• Ưu nhược điểm của phản ứng ngưng kết.
* Ƣu điểm:
• Phản ứng đơn giản, dễ làm, độ nhạy cao, ít tốn kém, được
sử dụng rộng rãi.
* Nhƣợc điểm:
• Hay cho phản ứng dương tính giả, khó đạt trình độ chính
xác cao.
Kết quả phản ứng giữa kháng nguyên gắn hạt Latex 
với kháng thể
Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
(2). Phản ứng kết tủa (Precipitation Test)
 Nguyên lý
• Kháng nguyên hoà tan khi gặp kháng thể tương ứng trong một tỷ lệ
thích hợp hiện tượng kết tủa xảy ra.
• Sự kết hợp của kháng nguyên với kháng thể tạo thành một phức
hợp: kháng nguyên - kháng thể - kháng nguyên - kháng thể -
hinh thành cấu trúc mạng lưới 3 chiều không gian, quan sát được
bằng mắt thường biểu hiện biểu hiện chất tủa màu đục.
 Trong phản ứng kết tủa nếu quá thừa kháng thể hoặc quá thừa
kháng nguyên thi sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể vẫn xảy
ra nhưng hiện tượng tủa không xuất hiện.
 Phản ứng kết tủa trong môi trƣờng lỏng
 Phản ứng kết tủa tạo vòng
 Là phản ứng có tính chất định tính.
 Dùng 1 ống nghiệm nhỏ, cho vào đó một lượng kháng
nguyên hoà tan (0.5ml).
 Cho 0.5ml kháng huyết thanh vào, cho vào từ đáy ống, kháng
huyết thanh sẽ đội kháng nguyên lên. Sau thời gian 15 - 20
phút tại vùng tiếp xúc sẽ xuất hiện một đĩa tủa mỏng.
 Phản ứng này được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh nhiệt
thán. Phản ứng kết tủa Ascoli.
 Phản ứng kết tủa trong môi trƣờng đặc (gel)
 Dùng thạch Agar để tạo môi trường đặc: phần đặc chỉ
chiếm 1- 2% khối lượng, 98 - 99% là chất lỏng. Thạch có
cấu trúc dạng sợi nên tạo được một cấu trúc lưới trong
không gian chứa được rất nhiều chất lỏng.
 Nguyên tắc: Trong môi trường gel, kháng nguyên và
kháng thể cách nhau một khoảng, chúng sẽ khuếch tán về
phía nhau, rồi gặp nhau. Nếu kháng nguyên, kháng thể
tương ứng sẽ kết hợp tạo phức hợp kháng nguyên - kháng
thể.
 Tại vùng có lượng kháng nguyên, kháng thể thích hợp
đường tủa sẽ xuất hiện. Có thể quan sát được hoặc muốn
rõ hơn thi nhuộm được.
 Phản ứng kết tủa trong thạch trong ống nghiệm
(kỹ thuật Oudin)
 Có thể chia làm 2 loại:
 Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn:
• Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho vào đó
một lượng kháng thể đã trộn lẫn với thạch.
• Trên mặt thạch cho một lượng dung dịch kháng nguyên.
Kháng nguyên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán vào
thạch, càng xuống sâu lượng kháng nguyên càng loãng.
• Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng sẽ xuất
hiện đường tủa dễ quan sát không bị tan khi lắc, thuận lợi
khi di chuyển hoặc chụp ảnh.
• Độ nhạy của phản ứng tăng gấp 2 - 3 lần so với khi thực
hiện phản ứng trong môi trường lỏng.
 Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép
• Dùng một ống nghiệm có đường kính nhỏ, cho kháng thể
vào trước,
• Rồi cho vào bên trên kháng thể một lượng thạch.
• Sau đó cho lên trên mặt thạch một lượng dung dịch kháng
nguyên.
• Kháng nguyên bên trên từ môi trường lỏng sẽ khuếch tán
đi vào trong thạch, kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên
cũng đi vào trong thạch.
• Ở nơi tỷ lệ kháng nguyên, kháng thể tương ứng sẽ xuất
hiện đường kết tủa.
• Trong cùng một ống nghiệm nếu dùng nhiều cặp kháng
nguyên, kháng thể khác nhau để chẩn đoán sẽ xuất hiện
nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau.
 Phản ứng kết tủa trong thạch trên phiến kính
hoặc đĩa petri (kỹ thuật Ouchterlony)
 Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch
kép, dễ làm, hay sử dụng. (Phản ứng AGP: Agar gel
precipitation).
 Trên phiến kính hoặc trên hộp petri, đổ một lớp thạch
mỏng 1 - 2mm.
 Khi thạch đông lại, đục các lỗ tròn: đường kính của lỗ 4 -
5mm, khoảng cách từ lỗ trung tâm với lỗ xung quanh; 5 -
6mm.
• Lỗ 1: Kháng nguyên đã biết
• Lỗ 2: Kháng thể tương ứng
• Lỗ 3, 4, 5, 6: Kháng thể chưa biết
• Kháng nguyên và kháng thể cách nhau một khoảng trong
thạch, chúng sẽ khuếch tán ra mọi phía, càng xa lỗ, nồng
độ càng loãng. ở nơi kháng nguyên, kháng thể tương ứng
sẽ xuất hiện đường tủa.
• Có thể dùng một hỗn hợp kháng thể để phát hiện nhiều
kháng nguyên trong dung dịch. Lúc đõ sẽ xuất hiện nhiều
đường tủa, mỗi đường tủa là một cặp đặc hiệu kháng
nguyên - kháng thể.
 Có thể thấy nhiều loại kết quả:
• Phản ứng giống hệt nhau: Khi 2 kháng nguyên y hệt nhau,
thi các đường kết tủa sẽ nối liền nhau.
- Phản ứng không giống hệt: Khi 2 kháng nguyên khác nhau,
sẽ kết hợp riêng rẽ với 2 kháng thể, hai đường tủa sẽ cắt
chéo nhau.
 Phản ứng kết tủa khuếch tán điện
 Là sự kết hợp phản ứng kết tủa với sự di chuyển trong điện
trường.
 Đây là một cải tiến rất có ý nghĩa.
 Dùng điện trường để đẩy nhanh tốc độ phản ứng kháng
nguyên - kháng thể.
 Kháng thể trong điện trường di chuyển về cực âm. Kháng
nguyên là chất bị hút về cực dương, chúng di chuyển gặp nhau
nhanh hơn (1 - 2 giờ thay vi 24 - 48 giờ).
 Phản ứng xảy ra cũng nhạy hơn (nhờ điện trường 90% kháng
nguyên, kháng thể đi ngược chiều nhau để gặp nhau, thay vi
khuếch tán tứ phía chỉ có 25% gặp nhau
 Miễn dịch điện di
Dùng điện trường để di chuyển hỗn hợp kháng nguyên
thành một dải kháng nguyên.
 Sau đó cho kháng thể vào một rãnh song song với hàng
kháng nguyên
Chúng sẽ khuếch tán, gặp nhau, các đường tủa sẽ nằm
cách xa nhau, thay vì nằm tập trung vào một vùng chật
hẹp. Vì vậy dễ quan sát và nhận định.
Miễn dịch điện di cho phép phát hiện kháng nguyên có
30 loại protein thay vì 5 - 6 trong điện di thường.
(3). Phản ứng kết hợp bổ thể (Phản ứng cố định bổ thể,
phản ứng tiêu thụ bổ thể)
 Là phản ứng huyết thanh học, có 3 thành phần tham gia:
kháng nguyên, kháng thể và bổ thể.
 Kháng thể trong phản ứng này thuộc lớp IgM, IgG có khả
năng hoạt hoá bổ thể. Khi kháng nguyên kết hợp với kháng
thể tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể, nếu có mặt
bổ thể bổ thể được hoạt hoá và gắn vào tạo thành: kháng
nguyên - kháng thể - bổ thể.
 Phản ứng được dùng để phát hiện kháng thể có khả năng hoạt
hoá bổ thể và định lượng bổ thể có trong huyết thanh.
 Phản ứng được thực hiện nhờ hai hệ thống: dung khuẩn, dung
huyết và sự tham gia của bổ thể.
 Hiện tƣợng dung khuẩn (Bacteriolysin)
Thí nghiệm của Faifơ (Pfaifer)
 Năm 1894 ông dùng vacxin phẩy khuẩn tả (vibrio
cholerae) tiêm cho chuột lang để gây miễn dịch.
 Đồng thời dùng chuột lang khác làm đối chứng không
tiêm vacxin.
 Sau 2 - 3 tuần dùng phẩy khuẩn tả cường độc tiêm vào
phúc mạc cho cả 2 loại chuột lang này với liều gây chết.
 Sau đó cứ 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ ông rút nước
phúc mạc kiểm tra vi khuẩn dưới kính hiển vi và nuôi cấy
vào môi trường lỏng để quan sát tính chất mọc của nó thi
thấy:
• Ở chuột lang được gây miễn dịch, nước phúc mạc sau 15
phút vi khuẩn mọc nhiều, sau thời gian này vi khuẩn giảm
dần, đến sau 2 giờ không còn vi khuẩn.
• Kiểm tra trên kính hiển vi: Nước phúc mạc lấy sau 15
phút, vi khuẩn không còn di động, vi khuẩn biến hình, phinh
dài ra. Nước lấy về sau vi khuẩn đã tan. Chuột lang này
sống.
• Ở chuột lang không được gây miễn dịch có hiện tượng
khác: Nước phúc mạc lấy về sau số lượng vi khuẩn càng
nhiều lên, kiểm tra trên kính hiển vi, vi khuẩn không bị biến
dạng, số lượng nhiều lên. Chuột lang này chết.
Minh hoạ thí nghiệm của P Faifer
Chuét thÝ nghiÖm
- Tiªm vacxin ph©y khuÈn tả
- Sau 2 - 3 tuÇn tiªm vi khuÈn
c-êng ®éc vµo phóc m¹c
- LÊy dÞch phóc m¹c kiÓm tra
Chuét ®èi chøng
- Kh«ng tiªm vacxin
- Tiªm vi khuÈn c-êng ®éc
- LÊy dÞch phóc m¹c kiÓm tra
Qua thí nghiệm nhận thấy trong huyết thanh của chuột lang
được gây miễn dịch có kháng thể đặc hiệu chống lại vi
khuẩn tả, sự kết hợp của kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên làm vô hiệu hoá vi khuẩn, đồng thời còn làm chúng
bị dung giải.
 Thí nghiệm của Borde
• Để làm rõ hơn, Borde đã làm thí nghiệm sau:
- Cho vi khuẩn tả kết hợp với huyết thanh miễn dịch tả còn
tươi có hiện tượng tan vi khuẩn tả.
- Cho vi khuẩn tả kết hợp với huyết thanh miễn dịch tả đã
được đun 560/30' vi khuẩn tả không bị tan.
- Cho vi khuẩn tả kết hợp với huyết thanh miễn dịch tả đã
đun 560C/30' và cộng thêm huyết thanh tươi của chuột
lang vi khuẩn tả bị tan.
- Cho vi khuẩn tả trộn với huyết thanh tươi bình thường của
chuột lang vi khuẩn không bị tan.
 Như vậy thí nghiệm này cho thấy trong huyết thanh
miễn dịch phải có 2 loại kháng thể cùng tham gia
làm tan xoắn khuẩn.
- Một loại kém chịu nhiệt, bị mất tác dụng khi đun ở
560C/30', không có tính đặc hiệu là kháng thể
không đặc hiệu gọi là bổ thể.
- Một loại chịu được nhiệt độ 560C/30' chỉ có trong
huyết thanh miễn dịch là kháng thể đặc hiệu, có khả
năng hoạt hoá bổ thể làm tan vi khuẩn.
- Như vậy, hiện tượng tan vi khuẩn phải có 3 thành
phần tham gia: kháng nguyên, kháng thể, bổ thể.
Hiện tƣợng tan vi khuẩn còn gọi là hiện tƣợng
dung khuẩn.
 Hiện tƣợng dung huyết (Haemolysis)
Hồng cầu của loài này là kháng nguyên đối với loài khác. Vì
vậy người ta lấy hồng cầu cừu tiêm vào dưới da cho thỏ, thỏ
sản sinh kháng thể chống lại hồng cầu cừu gọi là kháng thể
kháng hồng cầu cừu.
 Tuần tự làm 4 thí nghiệm nhƣ của Borde
- Hồng cầu cừu + kháng thể kháng hồng cầu cừu tan hồng
cầu Huyễn dịch có màu đỏ
- Hồng cầu cừu + kháng thể kháng hồng cầu cừu đun ở 560C/30'
 không tan hồng cầu, hồng cầu lắng xuống đáy, nước phía
trên trong.
- Hồng cầu cừu + kháng thể kháng hồng cầu cừu đun ở 560C/30'
+ huyết thanh chuột lang bình thường Tan hồng cầu.
- Hồng cầu cừu + huyết thanh chuột lang không tan hồng cầu
 Như vậy hiện tượng này cho thấy, để làm tan hồng cầu
trong huyết thanh kháng hồng cầu phải có 2 loại kháng
thể:
- Một loại là kháng thể không đặc hiệu, bị mất tác dụng
khi đun nóng ở 560C/30' đó là bổ thể.
- Một loại là kháng thể đặc hiệu có trong huyết thanh
miễn dịch, chịu được nhiệt 560C/30'. Kháng thể này có
khả năng làm tan hồng cầu nếu có sự tham gia của bổ
thể.
- Như vậy hiện tượng dung khuẩn hay hiện tượng dung
huyết muốn xảy ra, ngoài thành phần kháng nguyên-
kháng thể đặc hiệu còn có sự tham gia của bổ thể 
phản ứng tiêu thụ bổ thể.
 Cách tiến hành phản ứng kết hợp bổ thể
Phản ứng kết hợp bổ thể phải dùng hai hệ thống: Hệ thống
dung khuẩn và hệ thống dung huyết. Bởi vì sự dung khuẩn mắt
thường không quan sát được do đó phải dùng hệ thống dung
huyết để đánh giá kết quả qua quan sát bằng mắt thường.
• Chuẩn bị:
- Kháng nguyên: Là kháng nguyên đã biết
Ví dụ: VK Brucella Suis (Gây bệnh xảy thai truyền nhiễm trên lợn)
- Kháng thể: Là kháng thể nghi. Lấy máu của vật nghi mắc bệnh
chắt huyết thanh, đun 560C/30' diệt bổ thể.
- Hồng cầu cừu
- Huyết thanh kháng hồng cầu cừu đã đun 560C/30'
- Bổ thể: Huyết thanh chuột lang được chuẩn độ theo hệ thống
dung huyết.
 Cách làm:
 Cho vào ống nghiệm hệ thống dung khuẩn gồm có:
Kháng nguyên, kháng thể nghi và cho tiếp vào một lượng bổ
thể đã được chuẩn độ. Để ở 370C trong 20 - 30 phút.
 Cho tiếp vào ống nghiệm hệ thống dung huyết gồm có hồng
cầu cừu, huyết thanh kháng hồng cầu cừu. Để ở 370C trong
20 - 30', rồi đọc kết quả.
Phản ứng dương tính:
- Hồng cầu không tan lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, nước
ở bên trên trong. Đó là do: kháng nguyên + kháng thể tương
ứng + bổ thể.
- Bổ thể đã được sử dụng không còn cho hệ thống dung huyết.
Phản ứng dương tính chứng tỏ trong huyết thanh của vật nghi
có kháng thể tương ứng với kháng nguyên. Con vật mắc
bệnh.
Phản ứng âm tính:
- Hồng cầu bị tan, huyễn dịch có màu đỏ.
- Đó là do không có kháng thể tương ứng với kháng
nguyên, bổ thể không dùng cho hệ thống dung khuẩn
mà tham gia vào hệ thống dung huyết hồng cầu tan.
- Phản ứng âm tính, vật không mắc bệnh.
Phản ứng dương tính
Hồng cầu
Kháng thể kháng HC
Bổ thể từ HT của chuột
Kháng nguyên chuẩn
Kháng thể nghi
Phản ứng âm tính
Hồng cầu
Kháng thể kháng HC
Bổ thể từ HT của chuột
Kháng nguyên chuẩn
Kháng thể nghi
(4). Phản ứng trung hoà (Neutralization test)
 Một số kháng thể khi gặp kháng nguyên đã kích thích
sinh ra chúng như: virus, độc tố của vi khuẩn... sẽ làm cho
chúng không còn khả năng gây bệnh.
 Phản ứng kết hợp của kháng nguyên với kháng thể này
gọi là phản ứng trung hoà.
 Phản ứng trung hoà hay sử dụng là phản ứng trung hoà
độc tố và phản ứng trung hoà virus.
Phản ứng trung hoà độc tố của vi khuẩn
• Vi khuẩn uốn ván: Clostridium tetani.
• Vi khuẩn bạch hầu: Corynebacterium diphtheriae
• Những VK này có khả năng sản sinh ngoại độc tố và gây
bệnh nhờ độc tố này (Độc tố có bản chất là protein, có
tính KN cao).
• Độc tố rất độc, dưới tác dụng của một số yếu tố như nhiệt
độ, formol, độc tố mất độc tính trở thành giải độc tố,
nhưng tính kháng nguyên vẫn cao dùng làm vacxin.
• Khi tiêm giải độc tố vào cơ thể, cơ thể sản sinh kháng thể
đặc hiệu với độc tố, gọi là kháng độc tố.
• Khi kháng độc tố gặp độc tố, phản ứng trung hoà xảy ra
 độc tố không còn độc nữa.
• Phản ứng trung hoà độc tố có thể thực hiện trong cơ thể
động vật hoặc trong ống nghiệm.
• Nếu thực hiện phản ứng trung hoà trong ống nghiệm ta
thấy phức hợp kháng nguyên - kháng thể biểu hiện như
những cụm lông lơ lửng vì vậy người ta gọi là phản
ứng lên bông.
Phản ứng trung hoà virus
Nguyên lý:
• Trên đối tượng nuôi cấy virus: phôi gà, động vật cảm
thụ, môi trƣờng tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh
tích cho các đối tượng trên.
• Khi virus + kháng thể dịch thể đặc hiệu tương ứng 
virus sẽ bị trung hoà không nhân lên được và không
gây bệnh tích.
 Phản ứng trung hoà có 2 phƣơng pháp.
 Phương pháp thứ nhất:
 Huyết thanh không pha loãng (cố định), virus pha loãng.
 Theo phương pháp này virus được pha loãng theo cơ số 10: 10-
1 10-7..., rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết thanh
miễn dịch ở mỗi nồng độ. Để ở nhiệt độ phòng 30' 1 giờ, rồi
đem gây nhiễm cho đối tượng nuôi cấy virus (phôi gà hoặc động
vật thí nghiệm hoặc môi trường tế bào).
Mỗi nồng độ gây nhiễm cho 4 - 6 đối tượng nuôi cấy.
 Bằng phương pháp này người ta chuẩn độ được hiệu giá của
virus hỗn hợp trong huyết thanh
SƠ ĐỒ CỦA PHẢN ỨNG:
HuyÕt thanh
Sè
èng
Virus
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
HuyÕt thanh kh«ng
pha lo·ng, mçi èng
0,2ml
1
2
3
4
5
6
0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml
 Phương pháp thứ hai:
 Virus cố định, huyết thanh pha loãng.
 Theo phương pháp này, huyết thanh được pha loãng
theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/18...), rồi hỗn hợp với một
lượng virus nhất định (Nồng độ virus từ 100 đến 1000
TCID50, EID50, LD50, tuỳ mục đích thí nghiệm).
 Theo phương pháp này trước khi làm phản ứng phải
xác định được liều gây nhiễm hoặc liều gây chết 50%
đối tượng nuôi cấy virus (TCID50, EID50 và LD50).
 Phương pháp này ta xác định được hiệu giá của huyết
thanh trung hoà.
SƠ ĐỒ CỦA PHẢN ỨNG
Virus 
Sè 
èng
Huyết thanh
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
100LD50
(100LD50) mçi
èng 0,2ml
1
2
3
4
5
6
0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml
NHÓM CÁC PHẢN ỨNG KHÔNG 
NHẬN THẤY BẰNG MẮT THƢỜNG
 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang-IF (Immuno - fluorescent -
test)
Dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh
sáng có bước sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước sóng
dài hơn).
* Nguyên lý:
Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng
chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần
chẩn đoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên - kháng thể khi soi
dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng.
Dùng chất phát huỳnh quang:
- Fluorescent Isothiocyanat cho màu xanh lục
- Rodamin: màu đỏ gạch
- Lixamin - Rodamin B (RB200) đỏ vàng da cam
Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp.
* Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp:
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất
phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết.
Cách làm:
- Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (phiết bệnh
phẩm lên phiến kính, cố định) để kháng nguyên gắn chặt lên
phiến kính.
- Rỏ một giọt kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang lên
tiêu bản.
- Để một thời gian 30 phút, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính
hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). Đọc kết quả.
+ Phản ứng dương tính: Có hiện tượng phát sáng do có sự kết
hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh
quang.
+ Phản ứng âm tính: Không có phát sáng, do không có sự kết
hợp kháng nguyên - kháng thể.
Kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Miễn dịch huỳnh quang
 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
• Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát
hiện kháng nguyên cần chẩn đoán.
• Phương pháp này có 3 thành phần tham gia phản ứng.
- Kháng nguyên cần chẩn đoán
- Kháng thể đặc hiệu
- Kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang.
• Trong đó kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng:
- Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán
- Là kháng nguyên của kháng kháng thể đã đánh dấu.
Cách làm:
• Lấy bệnh phẩm cần chuẩn đoán làm tiêu bản để kháng nguyên gắn
chặt lên phiến kính.
• Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên phiến kính. Ủ 370C/1h, rửa
nước.
• Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Ủ
370C/1h, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính:
Có hiện tượng phát sáng, tức là có hiện tượng kết hợp kháng
nguyên + kháng thể + kháng kháng thể gia súc mắc bệnh.
- Phản ứng âm tính:
Không có hiện tượng phát sáng, tức là không có hiện tượng kết
hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng
nguyên và kháng thể không tương ứng, không có sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi.
Phƣơng pháp gián tiếp hay đƣợc sử dụng vì:
- Chỉ cần một lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta
có thể sử dụng để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với
điều kiện kháng thể đặc hiệu của chúng phải được chế trên cùng
một loài vật.
- Độ nhạy của phản ứng cao hơn, bởi vì 1 phân tử kháng nguyên
có thể bị nhiều kháng thể bám vào độ phát quang tăng lên,
dễ phát hiện.
Kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
 Kỹ thuật Sandwich Immunofluorescence Assay ("Bánh mì
kẹp chả")
 Đây là một dạng cải biến của miễn dịch huỳnh quang, dùng để
phát hiện tế bào tiết kháng thể.
 Cắt một mảnh tổ chức dạng lympho, đặt mảnh tổ chức lên
phiến kính.
 Lấy kháng nguyên phủ lên mảnh cắt. Để một thời gian, rửa
nước, loại bỏ kháng nguyên chưa gắn với kháng thể đặc hiệu
trên bề mặt tế bào lympho.
 Nhỏ tiếp kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang, để
một thời gian, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang. Đọc kết quả.
- Nếu có hiện tượng phát sáng, chứng tỏ các tế bào đang sản xuất
kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên.
 Phản ứng miễn dịch gắn enzim (Enzim linked Immuno
Sorbent Assay - ELISA)
Nguyên lý:
Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzim, rồi cho kết hợp
trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, sau đó cho cơ chất đặc
hiệu với enzim vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzim đã gắn tạo nên
màu
 Phản ứng ELISA trực tiếp: Dùng để chẩn đoán kháng nguyên
- Cho kháng nguyên cần chẩn đoán vào (kháng nguyên được chiết
xuất ở dạng hoà tan) để độ 1 giờ, rửa nước (loại bỏ những thành
phần thừa).
- Cho kháng thể đặc hiệu đã gắn enzim vào. Để một thời gian, rửa
nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzim vào, để một thời gian (20 - 30').
Đọc kết quả.
+ Nếu có màu tức là có kháng nguyên tương ứng với kháng thể đặc
hiêu, phản ứng dương tính.
+ Nếu không có màu: Phản ứng âm tính.
Phản ứng ELISA trực tiếp
ELISA
 Phản ứng ELISA gián tiếp: Dùng để phát hiện kháng thể
- Cho kháng nguyên đã biết hấp phụ lên bản nhựa, để một thời gian
(qua đêm), rửa nước để loại kháng nguyên thừa.
- Cho huyết thanh cần chẩn đoán vào, ủ 1 giờ/370C. Rửa nước loại
bỏ thành phần thừa.
- Cho kháng kháng thể tương ứng gắn enzim vào, ủ 1 giờ/370C, rửa
nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzim vào, ủ 1 giờ/370C, đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: Có màu xuất hiện
So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
Phản ứng âm tính: Không có màu xuất hiện
Trong phản ứng ELISA enzim có hoạt tính cao hay sử dụng
peroxydase, cơ chất dùng với enzim là 3,3' diaminobenzidin, dưới
tác dụng của enzim tạo màu nâu.
Phản ứng ELISA có độ nhậy cao.
Phản ứng ELISA gián tiếp
 Phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay)
Dùng chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ như I125, phát hiện bằng
máy đếm gamma (máy đo đồng vị phóng xạ).
• Nguyên lý (giống nhƣ miễn dịch huỳnh quang).
Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể được gắn đồng vị phóng
xạ, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần chuẩn. Nếu có phức hợp
kháng nguyên - kháng thể, khi đo trong máy đo đồng vị phóng xạ sẽ
có nhấp nháy.
Có 2 phƣơng pháp: Trực tiếp và gián tiếp.
Độ nhạy của phản ứng rất cao.
Độ nhạy của một số phản ứng huyết thanh học
+ Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc, phát hiện được kháng
nguyên ở nồng độ: 3 g/ml
+ Phản ứng ngưng kết trực tiếp 0,5g/ml
+ Phản ứng ngưng kết gián tiếp 0,001 g/ml
+ Kết hợp bổ thể 0,1 g/ml
+ Miễn dịch huỳnh quang 0,1 g/ml
+ Miễn dịch enzim 0,00001 g/ml
+ Miễn dịch phóng xạ 0,000001 g/ml